2014, Vol. 45
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.011 |
2. 安徽中医药大学药学院, 安徽省现代中药重点实验室, 安徽 合肥 230031
2. Anhui Key Laboratory for Modern Chinese Materia Medica, School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China
山茱萸Corni Fructus为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉[1]，性微温，味酸、涩，具有补益肝肾、收涩固脱功效。《中国药典》2010年版收载的山茱萸的饮片为山萸肉和酒萸肉，而临床应用主要以酒萸肉为主。传统的山茱萸炮制方法为取山萸肉用20%黄酒拌匀，置于适宜容器内，密闭，隔水加热，炖至酒被吸尽，色变黑润，取出干燥即可，一般情况下山萸肉的闷润时间为2 h，蒸制时间为4 h[2]。
本研究基于省时高效的理念采用高压蒸制山萸肉，通过在实验室条件下对加压酒蒸山茱萸[3]的炮制工艺进行单因素考察的基础上，以山茱萸中苷类成分马钱苷、莫诺苷以及三萜酸类成分熊果酸、齐墩果酸为指标，采用正交试验设计法对加压酒制山茱萸炮制工艺进行优选，为山茱萸加压酒制工艺研究提供参考依据。
1 仪器与材料Agilent 1260型自动进样高效液相色谱仪，含G1329B 1260 ALS、G1316A 1260 TCC、G4212B 1260 DAD、G1322A 1260 Degasser、G1312C 1260 Bin PumpVL、Agilent OpenLAB色谱工作站，美国安捷伦公司；Phenomenex Gemini-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Diamonsil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；AT系列溶剂过滤器。AS3120型超声清洗仪，Autoscience公司；CP225D型十万分之一电子天平，德国Sartorius公司；WL—100型打粉机，瑞安市威力制药机械厂；HHS111—2型电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHG—9140型电热恒温鼓风干燥箱，上海市三发科学仪器有限公司。
莫诺苷对照品（批号M-027-120414）、马钱苷对照品（批号M-010-110311），质量分数均≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；熊果酸对照品，批号110742-200516，质量分数≥99.3%，中国食品药品检定研究院；齐墩果酸对照品，批号120720，质量分数≥98%，宝鸡市方晟生物开发有限公司。
实验用山茱萸药材由安徽万生中药饮片有限公司提供，产地为河南，样本经过安徽中医药大学方成武教授鉴定为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸Comus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉。
甲醇、乙腈为色谱纯，天津大茂化学试剂厂；水为娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈饮料科技有限公司；其余试剂均为分析纯。海神牌黄酒，酒精度≥10.0%，安徽海神黄酒集团有限公司。
2 方法与结果 2.1 马钱苷和莫诺苷定量测定 2.1.1 对照品溶液的制备精密称定在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的马钱苷和莫诺苷对照品适量，加甲醇制成含马钱苷0.074 mg/mL、莫诺苷0.213 mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备取山茱萸粉末（过60目筛）0.1 g于100 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，冷却后再称定质量，用80%甲醇补充损失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。
2.1.3 色谱条件[4]及系统适用性试验色谱柱为Phenomenex Gemini-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相乙腈-水（15∶85），柱温30 ℃，体积流量1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长为240 nm。在此色谱条件下2个对照品与杂质峰的分离度＞1.5，理论塔板数均大于3 000，色谱峰对称性良好，见图 1。
 | 1-莫诺苷 2-马钱苷 1-loganin 2-morroniside图 1 马钱苷和莫诺苷混合对照品 (A) 及山茱萸样品 (B) 的HPLC图谱Fig. 1 HPLC of mix control of morroniside and loganin (A) and CorniFructus (B) |
在上述色谱条件下，分别设置已经配制好的马钱苷和莫诺苷混合对照品进样量为0.5、2、5、7、10、20 μL，依法测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），分别以马钱苷和莫诺苷质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，分别得回归方程：马钱苷Y＝23 835 X＋4.229 2，r＝0.999 8；莫诺苷Y＝12 930 X＋6.650 3，r＝0.999 9；表明马钱苷在1.85～74.0 μg/mL，莫诺苷在5.325～213.0 μg/mL峰面积与质量浓度具有良好的线性关系。
2.1.5 精密度试验吸取上述马钱苷和莫诺苷混合对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，分别测定峰面积值，马钱苷的RSD为0.40%，莫诺苷的RSD为0.17%，结果表明此实验仪器条件下测定马钱苷和莫诺苷的精密度良好。
2.1.6 重复性试验取同一样品6份，分别按定量测定项下的方法，测定其中马钱苷和莫诺苷的量，分别得马钱苷的RSD为1.69%，莫诺苷的RSD为1.46%。结果表明该方法测定山茱萸中马钱苷和莫诺苷重复性良好。
2.1.7 稳定性试验取样品溶液，在样品制备后0、3、6、12、18、24 h进样，测定每一次峰面积值，得马钱苷的RSD为1.30%，莫诺苷的RSD为0.91%。结果表明样品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验称取已测定马钱苷和莫诺苷量的山茱萸粉末0.1 g，同“2.1.2”项方法制得供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 mL于2 mL量瓶中，共6份，分别加入马钱苷和莫诺苷混合对照品0.5 mL，加色谱甲醇至刻度。在上述色谱条件下，测定峰面积，计算的马钱苷的平均回收率是100.63%，RSD为2.16%，莫诺苷的平均回收率99.28%，RSD为1.28%。结果表明本方法的准确度以马钱苷和莫诺苷的加样回收率计符合要求。
2.2 熊果酸和齐墩果酸定量测定 2.2.1 对照品溶液制备精密称定在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的熊果酸和齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成含熊果酸0.315 mg/mL和齐墩果酸0.156 mg/mL的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液制备取本品粗粉2 g，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇近刻度，在功率100 W下超声30 min，放冷后用甲醇定容，摇匀，滤过即得供试品溶液。
2.2.3 色谱条件[5]及系统适用性试验 Diamonsil- C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-［水-冰乙酸-三乙胺（30∶0.1∶0.05）］（88∶12），柱温25 ℃，体积流量1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长为210 nm。在此色谱条件下熊果酸对照品与杂质峰的分离度大于1.5，理论塔板数均大于3 000，色谱峰对称性良好，见图 2。
 | 1-齐墩果酸 2-熊果酸 1-ursolic acid 2-oleanolic acid图 2 齐墩果酸和熊果酸混合对照品 (A) 和山茱萸样品(B) 的HPLC图谱Fig. 2 HPLC of mix control of ursolic acid and oleanolic acid (A) and Corni Fructus (B) |
在上述色谱条件下，分别设置已经配制好的熊果酸和齐墩果酸混合对照品进样量为2、5、7、10、15、20 μL，依法测定，以峰面积为纵坐标（Y），分别以熊果酸和齐墩果酸质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，分别得回归方程：熊果酸Y＝9 181.9 X＋21.481，r＝0.999 7；齐墩果酸Y＝9 212.1 X＋3.357 1，r＝0.999 7；表明熊果酸在31.5～315.0 μg/mL，齐墩果酸在15.6～156.0 μg/mL峰面积与质量浓度间具有良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验吸取上述熊果酸和齐墩果酸混合对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，分别测定峰面积值，熊果酸的RSD为0.39%，齐墩果酸的RSD为0.59%，结果表明此实验仪器条件下测定熊果酸和齐墩果酸量的精密度良好。
2.2.6 重复性试验取同一样品6份，分别按定量测定项下的方法，测定其中熊果酸和齐墩果酸的量，分别得熊果酸RSD为2.32%，齐墩果酸RSD为2.47%。结果表明测定本品中熊果酸和齐墩果酸的量重复性良好。
2.2.7 稳定性试验取样品溶液，在样品制备后0、3、6、12、18、24 h进样，测定每一次峰面积值，得熊果酸的RSD为0.94%，齐墩果酸的RSD为2.33%。结果表明样品在24 h内稳定性良好。
2.2.8 加样回收率试验称取已测定熊果酸和齐墩果酸量的山茱萸粉末2 g，采用“2.2.2”项方法制得供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 mL于2 mL量瓶中，共6份，分别加入熊果酸和齐墩果酸混合对照品0.5 mL，加色谱甲醇至刻度。在上述色谱条件下，测定峰面积，计算的熊果酸的平均回收率是97.53%，RSD为1.28%，齐墩果酸的平均回收率100.08%，RSD为1.98%。结果表明本方法的准确度以熊果酸和齐墩果酸的加样回收率计符合要求。
2.3 正交试验设计根据《中国药典》2010年版一部以及《中药炮制学》，酒山茱萸一般选用黄酒的加酒量为20%左右，闷润时间为0～4 h，蒸制时间一般为4～8 h。研究山茱萸的加压工艺，选用加酒量（A）、闷润时间（B）、蒸制时间（C）以及蒸制温度（D）作为考察因素，每个因素拟定3个水平，见表 1，采用L9(34) 正交试验设计对A、B、C及D进行优选，实验安排及结果见表 1。
|
表 1 L9(34) 正交试验设计与结果 Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test |
分别各取山茱萸生品200 g，按L9(34) 正交设计表，加不同的酒量，闷润规定的时间，在设定的温度下于高压灭菌锅中蒸制一定的时间，取出于80 ℃烘干。
2.5 正交试验方法与结果按照L9(34) 正交表进行正交试验，每组试验平行3次，分别计算马钱苷、莫诺苷、熊果酸和齐墩果酸的质量分数，按照综合加权评分法进行综合评分与分析，选择马钱苷权重系数为0.4，莫诺苷权重系数为0.25，熊果酸权重系数为0.25，齐墩果酸权重系数为0.1[6,7]，最后得到综合评分（综合评分＝马钱苷×0.4＋莫诺苷×0.25＋熊果酸×0.25＋齐墩果酸×0.1）。实验结果见表 1，方差分析见表 2。
|
|
表 2 方差分析结果 Table 2 Results of ANOVA |
由方差分析（ANOVA）结果可知，A、C、D因素都无统计学意义，B因素有统计学意义，从省时和经济的角度，最佳工艺应选A3B1C3D2，即最佳加压酒制工艺：取山茱萸净药材，加入山茱萸质量的25%的黄酒拌匀，闷润30 min，在高压灭菌锅升温升压，当温度达到115 ℃时维持60 min，后取出，80 ℃烘干。炮制品为紫黑色，有光泽且质量较好。
2.6 验证试验为进一步验证结论的准确性，按正交试验得出的最佳工艺方法进行6次炮制试验，观察样品炮制后的性状，对炮制品中有效成分进行测定，结果见表 3。
|
|
表 3 验证试验结果 Table 3 Results of verification test |
按正交试验结果进行验证试验，测定山茱萸炮制品中马钱苷的平均质量分数为0.930 4%，莫诺苷的平均质量分数为2.915 5%，熊果酸的平均质量分数为0.170 6%，齐墩果酸的平均质量分数为0.07%，结果表明工艺合理，稳定可行。
本实验以山茱萸中的苷类成分马钱苷和莫诺苷以及三萜酸类成分熊果酸和齐墩果酸作为山茱萸药材的控制指标，从山茱萸中有效成分的量，全面控制山茱萸药材的质量，为实验的可行性提供足够的依据。
本实验在山茱萸传统的炮制基础上采用高压方法，大大节省了时效和成本，且炮制品的色泽和质量稳定，高压炮制法是中药炮制的新方向，有着炮制周期短样品质量可靠等优点，本实验通过高压对山茱萸进行炮制，为其在工厂大规模生产提供技术支持。
| [1] | 中国药典[S]. 一部. 2010. |
| [2] | 丁安伟. 中药炮制学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2007. |
| [3] | 左文, 陆兔林, 毛春芹, 等. 正交试验法优选山茱萸高压酒蒸工艺的研究[J]. 中草药, 2010, 41(3): 403-405. |
| [4] | 张振凌, 呼海涛, 刘博, 等. 不同工艺酒制山茱萸马钱素、莫诺苷含量比较[J]. 中药材, 2007, 30(10): 1217-1219. |
| [5] | 查孝柱, 谢晓梅, 吕美红, 等. 含齐墩果酸和熊果酸的10种果实类中药HPLC分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(18): 60-62. |
| [6] | 褚思娟, 李林, 张兰. 山茱萸环烯醚萜苷主要药理作用研究进展[J]. 中国医药, 2013, 8(4): 568-570. |
| [7] | 刘博, 吴和珍. 山茱萸药材中三萜类成分的研究[J]. 湖北中医杂志, 2010, 32(12): 75-77. |