总苷成分群是最常见的中药成分群之一。苷类亦称苷或配糖体，是由糖或糖的衍生物与另一非糖物质通过糖的半缩醛或半缩酮羟基与苷元脱水形成的一类化合物。总苷是所有含糖苷键的成分总称。几乎所有的天然产物均可与糖或糖的衍生物形成苷，所以苷的性质千变万化、结构各异，至今没有建立一种针对糖苷键的总苷定量测定方法。目前常以结构相似的成分作对照品，采用比色法、紫外可见分光光度法等方法测定近似的量^[1]。因此在总苷中，对于结构相差不大的苷类，可以用相近结构的成分作对照品来测定。但是对于结构式相差很大，如皂苷、黄酮苷、蒽醌苷等，建立一种以糖苷键为目标的配糖体定量测量方法显得十分重要^[2]。据此本实验将创立一种基于糖苷键为核心的配糖体的差式蒽酮-糖脎比色法。该法首先用乙醇除去多糖，再用蒽酮比色法测定总糖基（包括糖类）的量，再采用糖脎硫酸显色法测定还原性糖类的量，两者相减即得含糖苷键的成分群即总苷类成分的量。这种方法适用于所有含有苷键的化合物，因此是测量总苷成分的有效方法^[3]。

蒽酮比色法是一个快速而简便测定糖的方法。首先含糖苷的成分在浓硫酸的作用下水解成已游离的己糖、戊糖及己糖醛酸，并进一步脱水生成糠醛衍生物，再与蒽酮反应呈蓝绿色。本法多用于测定糖苷、多糖的量，也可用于葡萄糖的定量测定^[4]。

糖与苯肼作用得到糖脎，是用来鉴别糖的一个重要反应。不同的糖脎晶型不同，成脎所需要的时间也不同，并各有一定的熔点。脎的化学结构实质是一个二苯腙，凡是α-羟基醛和α-羟基酮均有此反应，即能形成糖脎者，结构中必须有游离的醛基或酮基。因此只有还原糖才有此反应发生，苷类成分因不具备α-羟基酮（醛）结构而不能成脎，利用此性质可消除还原性糖对总苷成分定量测定的干扰^[5]。

总苷类由糖和非糖物质通过糖的半缩醛或半缩酮羟基结构脱水形成，故总苷分子中不存在羟基半缩醛结构，不体现α-羟基酮（醛）性质，为非还原性糖，可利用其不能成脎的性质，通过蒽酮比色法与糖脎硫酸显色法差值对中药复方中总苷类成分的量进行定量测定。蒽酮比色法适宜测定总糖苷的量（包括糖类），而对于没有形成苷键的糖多具有α-羟基酮（醛）结构，体现还原性，能形成糖脎，故可用糖脎硫酸显色法测定。两者测得的量相减，可得半缩醛（酮）羟基成键后的总苷类成分的总量。

TU—1990型紫外分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司；MA110型电子天平，上海天平仪器厂；ZK—82A型真空干燥箱，上海实验仪器总厂；恒温水浴锅、可调温电炉，上海实验仪器总厂。蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

六味地黄丸：产品批号201208006，九芝堂股份有限公司，每8丸相当于3 g药材饮片；黄芪注射剂：产品批号1304232，正大青春宝药业有限公司，10 mL相当于20 g饮片药材；茯苓多糖口服液：产品批号20121001，湖南补天药业有限公司；穿心莲片：产品批号13030102，哈药集团三精千鹤制药有限公司；补阳还五汤复方药材处方：黄芪60 g、当归9 g、川芎6 g、赤芍9 g、桃仁9 g、红花9 g、地龙9 g，药材采购于湖南长沙医林药号，由湖南中医药大学药学院刘文龙副教授鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根，川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根茎，赤芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根茎，桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica (L.) Batsch的干燥成熟种子，红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L. 的干燥花，地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier) 的干燥主体。

0.1%蒽酮溶液：称取0.1 g蒽酮和1.0 g硫脲，溶于100 mL 72%硫酸中，贮存于棕色瓶中，于0～4 ℃下存放，可保存1周，最好现配现用；72%硫酸溶液；苯肼试剂：5 g盐酸苯肼溶于适量水中，微热使之溶解（若有色，加少量活性炭脱色滤过），然后加9 g醋酸钠晶体，搅拌溶解，加蒸馏水至100 mL，于0～4 ℃下存放；50%硫酸溶液。

精密称取D-葡萄糖100.2 mg于100 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，即得1 mg/mL的D-葡萄糖对照品溶液，分别精密吸取4、5、6、7、8、9 mL的1 mg/mL D-葡萄糖对照品溶液，置50 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，得到80、100、120、140、160、180 μg/mL的系列对照品溶液。

精密称取D-葡萄糖10.001 2 g于100 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，即得0.1 g/mL的D-葡萄糖对照品溶液，分别精密吸取1、2、3、4、5、6 mL的0.1 g/mL的D-葡萄糖对照品溶液，置50 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，得到2、4、6、8、10、12 mg/mL的系列对照品溶液。

称取处方量111 g补阳还五汤方药材，加888 mL倍量蒸馏水回流提取。吸取提取液5 mL（相当于原药材0.625 g）药液置小烧杯中，加入95%乙醇使含醇量达到85%，静置过夜后，离心去沉淀，将上清液倒入50 mL量瓶中，用85%乙醇定容至刻度即得差式蒽酮-糖脎比色法样品溶液1。因补阳还五方为常见的含有总苷成分群的方剂，故以此方进行方法学考察试验。

称取0.4 g六味地黄丸（相当于原药材0.625 g）按上述方法处理，得到样品溶液2。 3.2.3 黄芪注射剂

取0.416 5 mL黄芪注射剂液（相当于原药材0.625 g，根据黄芪注射剂的含量换算，使得黄芪注射剂和补阳还五汤的原药材都等于0.625 g，便于黄芪注射剂和补阳还五汤的比较）按上述方法处理，得到样品溶液3。

吸取茯苓多糖口服液0.416 5 mL（同黄芪注射剂液体积，便于比较）于5 mL量瓶中定量，按上述方法处理，得到样品溶液4。

称取穿心莲片0.4 g（同六味地黄丸质量，便于比较）按上述方法处理，得到样品溶液5。

3.3.1 蒽酮比色法

取总苷样品液按蒽酮比色法操作进行，即取稀释后的样品液1 mL，置具塞试管中，沿管壁加入4 mL 0.1%蒽酮溶液，立刻摇匀浸入沸水浴中。在水浴中准确煮沸10 min后取出，用冰水浴迅速冷却至室温显蓝色。于紫外可见分光光度计上以蒸馏水同样操作为空白扫描，得到样品在620 nm处有最大吸收。分别取样品液、对照品葡萄糖液、空白蒸馏水2 mL按上述方法进行操作。于紫外可见分光光度计上以蒸馏水同样操作为空白扫描，得到样品、对照品620 nm处有最大吸收。结果见图 1。

图 1 蒽酮比色法样品液 (a)、对照品液 (b) 和空白液 (c)不同波长下的吸收曲线Fig. 1 Absorption curves of anthrone colorimetry sample solution (a),reference solution (b),and blank solution (c) under different wavelengths

取总苷样品液0.5 mL，置具塞试管中，加入1.5 mL苯肼试剂，充分振荡此溶液，并将试管放在沸水浴中加热90 min，室温冷却后用50%的硫酸显黄色。然后用紫外分光光度计进行波长扫描，在418 nm处有强吸收峰。取样品液、对照品葡萄糖液、空白蒸馏水各2 mL按上述方法进行操作。于紫外可见分光光度计上以蒸馏水同样操作为空白扫描，得到样品、对照品在418 nm处有最大吸收。结果见图 2。

图 2 糖脎硫酸显色法样品液 (a)、对照品液 (b)、空白液 (c) 不同波长下的吸收曲线Fig. 2 Absorption curves of sugar hydrazone sample solution of sulfuric acid colorimetric method (a),reference solution (b),and blank solution (c) under different wavelengths

（1）蒽酮比色法：取总苷样品液稀释一定倍数后，取样本数3份按蒽酮比色法操作，于620 nm测定0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0 h的吸光度（A）值，取平均值，计算RSD，结果见表 1。可知反应应在6 h内完成。精密吸取样品液稀释一定倍数后，按蒽酮比色法操作，分别在0、1、2、4、6 h测定，得A值分别为0.599、0.613、0.595、0.583、0.543，其RSD为2.48%，表明稳定性良好。

表 1(Table 1)

表 1 不同时间样品液的A值 (蒽酮比色法) Table 1 A values of sample solution (anthrone colorimetry) at different time t / h A RSD / % t / h A RSD / % 0.5 0.614 － 4.0 0.583 2.13 1.0 0.613 0.12 5.0 0.554 3.45 2.0 0.595 1.76 6.0 0.543 4.38 2.5 0.597 1.67 7.0 0.522 5.54 3.0 0.588 1.92 9.0 0.515 6.34

表 1 不同时间样品液的A值 (蒽酮比色法) Table 1 A values of sample solution (anthrone colorimetry) at different time

（2）糖脎硫酸显色法：取总苷样品液样本数3份按糖脎硫酸显色法操作，于418 nm测定0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0 h的A值，取平均值，计算RSD，结果见表 2。可知反应应在4 h内完成。精密吸取样品液稀释一定倍数后，按糖脎比色法操作，分别在0、1、2、3、4 h测定，得A值分别为0.280、0.284、0.293、0.311、0.314，其RSD为2.54%，稳定性良好。

（1）蒽酮比色法：吸取系列对照品溶液各1 mL，按蒽酮比色法测得对应A值，由A值（Y）对质量浓度（X）进行回归，得回归方程Y＝0.006 7 X－0.116 8，R²＝0.994，在80～180 μg/mL两者线性关系良好。

表 1(Table 1)

表 2 不同时间样品液的A值 (糖脎硫酸显色法) Table 2 A values of sample solutions (sugar hydrazone sulfuric acid colorimetricmethod) at different time t / h A RSD / % t / h A RSD / % 0.5 0.281 － 4.0 0.314 4.91 1.0 0.284 0.75 5.0 0.334 6.21 2.0 0.293 2.18 6.0 0.345 7.36 2.5 0.310 4.47 7.0 0.349 8.01 3.0 0.311 4.78 9.0 0.353 8.43

表 2 不同时间样品液的A值 (糖脎硫酸显色法) Table 2 A values of sample solutions (sugar hydrazone sulfuric acid colorimetricmethod) at different time

（2）糖脎硫酸显色法：吸取系列对照品溶液各1 mL，按糖脎硫酸显色法测得对应A值，由A值（Y）对质量浓度（X）进行回归，得回归方程Y＝0.424 5 X－0.031 5，R²＝0.991，在2～12 mg/mL两者线性关系良好^[7]。

（1）蒽酮比色法：精密吸取总苷样品液稀释一定倍数后，按蒽酮比色法操作，重复5次，依次测得其A值为0.585、0.583、0.585、0.581、0.562，其RSD为1.68%，表示本法精密度良好。

（2）糖脎硫酸显色法：精密吸取总苷样品液，按糖脎硫酸显色法操作，重复5次，依次测得其A值为0.311、0.310、0.297、0.310、0.306，其RSD为1.89%，表示本法精密度良好。

分别精密吸取总苷样品液1 mL，共5份，每份加入对照液l mL，分别按蒽酮比色法和糖脎硫酸显色法操作，测得总样品A值，依照回归方程计算出质量浓度，再计算出总量，根据已加入总苷样品量计算出对照品量，再与对照品加入量之比得回收率。测得蒽酮比色法的回收率为99.00%，RSD为0.96%，糖脎硫酸显色法的回收率为103.00%，RSD为3.17%。提示2法有较好的精确度。

依据上述操作进行样品中总糖（包括苷类）及还原糖的定量测定，根据蒽酮比色法的A_max平均值在标准曲线上查出葡萄糖的量，具体计算方法如下。

样品总糖（包括糖苷类）量（W_蒽）＝C₁×V_测×D，然后再根据糖脎硫酸显色法A_max平均值在标准曲线上查出还原糖的量。

样品液中还原糖（W_脎）＝C₂×V_测×D，其中，C为在标准曲线上查出的糖量（μg），V_测为测定时取用体积（mL），D为稀释倍数。

最后得到总苷类成分的量，即总苷类成分量（W）＝W_蒽－W_脎。

将处理的5个样品取样本数3份经过一定倍数的稀释后，按蒽酮比色法操作进行，于紫外可见分光光度计上以蒸馏水同样操作为空白扫描，得到样品在620 nm处左右有吸收，记录A值平均值，结果见表 3。

将处理的5个样品取样本数3份按糖脎硫酸显色法操作进行，于紫外可见分光光度计上以蒸馏水同样操作为空白扫描，得到样品在418 nm处左右有吸收，记录A值平均值。将A值平均值结果分别带入标准曲线，求得质量浓度。再根据体积和稀释的倍数分别求得W_蒽和W_脎。最后得到总苷类成分质量分数，结果见表 3。

表 1(Table 1)

表 3 不同药物总苷类有效成分群定量结果 Table 3 Quantitative determination of total glycosides active ingredient group in different drugs 药物名称 蒽酮比色法 糖脎硫酸显色法 取样量 总苷 / mg 含量 A值 质量 / mg A值 质量 / mg 补阳还五方 0.781 13.410 0.321 0.830 0.833 g 12.700 1.511% 六味地黄丸 0.673 11.804 0.575 1.431 0.401 g 10.423 2.602% 黄芪注射剂 0.517 9.464 0.207 0.562 0.417 mL 8.901 21.300 mg/mL 茯苓多糖口服液 0.404 7.732 0.274 0.720 0.417 mL 7.012 16.922 mg/mL 穿心莲片 0.089 3.070 0.132 0.385 0.403 g 2.694 0.668%

表 3 不同药物总苷类有效成分群定量结果 Table 3 Quantitative determination of total glycosides active ingredient group in different drugs

苷类是中药成分群最常见的成分，因与糖基的配体不同而成分结构千差万别，目前只有总苷的化学名称，却没有针对这群成分特征的总体定量测定方法，这缘于糖配体复杂多样，性质迥异，难有针对配体设计合理的方法；同时多糖也可看成苷类结构（一糖半缩醛羟基与别一糖的羟基缩合而成），如以糖基为测定目标，则又会受到其他糖的干扰，因此怎样巧妙地利用糖苷键的特点来建立总苷的测定方法备受关注。

众所周知，总苷定量测定研究一直以来都是对其中某一类成分进行测定，而很少将其作为总苷有效成分群来进行宏观定量测定^[8]，这缘于总苷的定量测定方法不易建立。为此，本实验根据糖的端基碳原子的半缩醛结构的特点，当与非糖配基结合形成苷后其还原性消失，当与糖配基结合形成的聚糖，或没有与糖配基结合的单糖，其结构中均存在α-羟基酮（醛），体现还原性。因此可先采用乙醇沉淀除去多糖，然后使糖苷结构水解出单糖，脱水生成5-羟基糠醛衍生物，再与蒽酮反应显蓝色，据此测定含糖苷键的总成分群；再利用未与羟基结合糖基的半缩醛结构的还原性，能用糖脎反应来测定聚糖和单糖，2次测定结果相减便获得仅含与非糖配基结合糖苷键的总苷成分群的量。

在蒽酮反应中，使总苷键水解脱水生成5-羟基糖醛衍生物是重要的步骤，因此需要加入脱水剂或通过加热才能使反应易于进行。后续与蒽酮显色要注意反应完全、稳定，才能进行比色测定。在糖脎反应中，冷却速度对糖脎的形成十分重要。当糖脎具有明显黄色的反应液从水浴中出现，应于室温下放置自然冷却。这是由于随冷却时间的延长，结晶越来越完善。若将反应液从水浴中取出进行急冷或用玻璃棒摩擦试管壁，由于迅速结晶导致晶体不能有序排列就会出现团块状如棉团状的悬浮物的糖脎。这是实验中最常出现的结果，应该避免。

本实验将蒽酮比色法与糖脎硫酸显色法结合创立了中药复方中总苷类成分定量测定方法，由于没有能代表整体总苷的对照品，因此该法的精确度受到限制，但能满足总苷类成分的量测定的要求，由前述比色法的方法学也证明了本法可用于不同种类的总苷的定量测定。采用本法对补阳还五汤、六味地黄丸、黄芪注射剂、茯苓多糖口服液、穿心莲片的总苷进行了定量测定，其中以六味地黄丸中含总苷成分最多，以穿心莲片含总苷成分最少，这与文献报道一致^[9,10]，说明本法是可以用来测定不同形式的总苷成分群。

值得注意的是本法是基于糖苷键的半缩醛原子结构特点而建立起来的测定方法，当糖半缩醛原子彼此聚合时，如蔗糖还原性消失，可体现出苷的性质；当糖半缩醛原子依次聚合时，只有端基糖的半缩醛结构具有还原性，而表现出一分子单糖的还原性效果，这些都会影响糖脎测定结果，最终使所测总苷结果偏高，因此要使本法进一步精确，可采用适宜的方法尽可能地预先除去糖类成分，特别是多糖、低聚糖与蔗糖等。