胡黄连Picrorhiza kurrooa Pennel为玄参科胡黄连属的多年生草本植物，分布区比较狭窄，特产于横断山区和东喜马拉雅。其具有保肝利胆、抗菌消炎、抗哮喘、降血糖、神经保护、免疫调节等多种药理作用，临床上应用非常广泛，环烯醚萜苷类成分是其主要作用成分之一^[1,2]。近些年，由于过度采挖，野生胡黄连资源濒临枯竭，其作为国家二级保护植物，已被列入《中国珍稀濒危保护植物名录》^[3]，对其继续科学保护和合理利用已刻不容缓。萜类化合物（terpenoids）又称类异戊二烯，是自然界中分布最广泛、结构最复杂的一类次生代谢化合物^[4,5,6,7,8]。其在植物生理过程中发挥着重要作用，部分萜类化合物还具有重要的药用价值和较高的经济价值。随着分子生物学和生物信息学等学科的发展，萜类化合物的合成途径及合成过程中的关键酶成为植物次生代谢研究领域的热点之一。绝大多数萜类化合物的合成前体是异戊烯基焦磷酸（IPP），植物体内IPP的生物合成主要存在2条不同的代谢途径：一是位于细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径，另一条是位于质体中的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径^[9]。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酸转移酶（MCT）催化MEP途径中的第3个反应，即催化CDP和EP在胞苷三磷酸（CP）的参与下合成CDP-ME，是IPP合成的关键酶之一^{[10,11,12,13]}。

Rohdich等^[14]使用同位素标记法验证了MCT在大肠杆菌萜类前体物质生物合成中的重要作用。此外，MCT缺失型E. coil菌株NMW33人为添加MVA，可以在LB平板上生长，而缺失型不生长，这说明了MCT是IPP生物合成所必需的^[15]。近年来，相继有文献报道多个物种的MCT基因得到解析，但尚未有报道利用生物信息方法系统研究这些基因，这制约其他物种中该基因的克隆与功能验证。生物信息学是生命科学和信息科学的交叉学科，是后基因组时代的重要研究工具之一。本实验利用生物信息学的方法对胡黄连MCT基因以及GenBank上已发表的其他植物MCT基因进行序列分析和功能预测，旨在为其他植物MCT基因的克隆、功能验证提供理论和实践参考依据。

样品采自印度罗唐山隘和Palampur研究所保护地收集，经笔者鉴定为胡黄连Picrorhiza kurrooa Pennel。

参照NCBI数据中报道的胡黄连（JQ991625.1）、拟南芥Arabidopsis thaliana Carl Linnaeus（NM_126305.2）、丹参Salvia miltiorrhiza Alexander Bunge（JN831096）、蓖麻Ricinus communis James A. Duke（XM_002540422.1）、罗汉果Siraitia grosvenorii C. Jeffrey ex Lu et Z. Y. Zhang（HQ128560.1）、萝芙木Rauvolfia verticillata Henri Ernest Baillon（JX104650.1）、毛果杨Populus trichocarpa John Torrey & Asa Gray（EU693021.1）、橡胶Hevea brasiliensis Johannes Müller Argoviensis（AB294703.1）和银杏Ginkgo biloba Carl Linnaeus（DQ102360.1）的MCT基因的mRNA序列以及其编码的蛋白质序列。

胡黄连MCT基因mRNA序列由叶组织中提取获得的RNA反转录合成cDNA特异性扩增获得^[16,17,18]。利用BioEdit软件分析胡黄连MCT基因mRNA序列和氨基酸序列的相对分子质量、碱基；利用NCBI网站的ORF Finder程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）预测开放阅读框（ORF）利用BioEdit软件对胡黄连MCT基因的氨基酸序列进行初步疏水性分析，再通过Expasy的Protscale程序（http://expasy.org/csibin/ protscale.pl/），使用Hphob./Kyte & Doolittle方法对其进行详细的疏水性分析，并获得氨基酸组成、碱基分布、氨基酸比例等；将获得的氨基酸序列利用Clustal X软件进行氨基酸序列之间的多重比对分析；利用DNAman软件对9种植物MCT基因的氨基酸序列构建进化树；在NCBI中对胡黄连MCT蛋白的保守序列进行预测，以及二级结构、三级结构的预测分析^{[19,20,21,22]}。

通过BioEdit软件和NCBI网站分析发现，胡黄连MCT基因mRNA序列长为1 216 bp，其含有多个复制起始位点，ORF在148～1 083 bp，共编码311个氨基酸，相对分子质量为367 599.00。从表 1可以看出，A＋T量较高为62.09%；G＋C量较少为37.91%。

表 1(Table 1)

表 1 胡黄连MCT基因mRNA序列的碱基组成 Table 1 Basecomposition of mRNA sequence of MCT gene in P. kurrooa 碱基类型 数目 含量 / % A 357 29.36 C 224 18.42 G 237 19.49 T 398 32.73

表 1 胡黄连MCT基因mRNA序列的碱基组成 Table 1 Basecomposition of mRNA sequence of MCT gene in P. kurrooa

由表 2可知，胡黄连MCT基因编码的蛋白质中共有20种氨基酸，共计399个氨基酸，相对分子质量为44 448.5，其中量最高的为Ser，为10.0%；Leu、Val、Lys、Ile也较多，分别为9.8%、8.0%、7.8%、7.3%；而量最低的是Trp，为0.5%。N端第一个氨基酸为Gly。

表 2(Table 2)

表 2 胡黄连MCT编码的蛋白质的氨基酸组成 Table 2 Composition of amino acid of MCT protein in P. kurrooa 氨基酸名称 数目 含量 / % Ala 21 5.3 Cys 13 3.3 Asp 18 4.5 Glu 21 5.3 Phe 24 6.0 Gly 20 5.0 His 9 2.3 Ile 29 7.3 Lys 31 7.8 Leu 39 9.8 Met 6 1.5 Asn 16 4.0 Pro 22 6.0 Gln 12 3.0 Arg 11 2.8 Ser 40 10.0 Thr 19 4.8 Val 32 8.0 Trp 2 0.5 Tyr 14 3.5

表 2 胡黄连MCT编码的蛋白质的氨基酸组成 Table 2 Composition of amino acid of MCT protein in P. kurrooa

组成蛋白质的氨基酸分子都具有一定的极性，这些氨基酸分子的极性对蛋白质高级结构及功能性结构域的形成有重要的影响。分析可知该蛋白为稳定蛋白。从图 1可知，疏水值最大为3.167，375 bp处的疏水性最强，疏水值最小为-2.244，88 bp处亲水性最强。整个多肽中含59.5%的疏水性氨基酸，疏水性平均值为0.050，推断该蛋白为疏水性蛋白。

图 1

Fig. 1

图 1 胡黄连MCT基因编码氨基酸的疏水性预测 Fig. 1 Hydrophobicity prediction of amino acid sequence of MCT gene in P. kurrooa

对MCT的氨基酸序列进行同源性分析（图 2），结果表明胡黄连与丹参、拟南芥、罗汉果、萝芙木、橡胶、银杏具有较高同源性，保守区主要集中在中部和尾部，而N端变异性比较大。由于基因进化等原因，也存在较大差异的区段，这些区段可能为基因进化理论研究提供一些参考依据。BlastP的结果表明MCT属于糖基转移酶（GT-A）家族。

图 2

Fig. 2

图 2 MCT序列氨基酸的多重比对分析 Fig. 2 Multiple comparison analysis of amino acid of MCT sequence

由图 3可知，胡黄连与丹参亲缘关系最近，属于同一目即唇形目，与萝芙木分支较近，与蓖麻、橡胶、罗汉果、银杏较远。

图 3

Fig. 3

图 3 MCT基因编码氨基酸序列进化树 Fig. 3 Evolutionary tree of amino acid sequence of MCT gene

保守序列（conserved sequence）对推测进化结果有特殊意义。在NCBI的蛋白保守结构域数据库（conserved domain database，CDD）中对MCT进行蛋白保守区预测，结果表明（图 4）与该基因匹配的蛋白为MCT，保守序列在中间和C端，这也印证了不同物种的氨基酸序列之间的多重比对分析结果。

图 4

Fig. 4

图 4 胡黄连MCT保守结构区域的预测 Fig. 4 Prediction of conserved domain of MCT protein in P. kurrooa

用SOPMA对胡黄连MCT二级结构分析表明（表 3和图 5），该蛋白由20.58%的α-螺旋、29.26%的延伸链、9.65%的β-转角及30.51%的无规则卷曲组成。无规则卷曲是胡黄连MCT中最多的结构元件。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构，而该蛋白的生物学功能由高级结构所决定。采用Swiss-Model得到MCT蛋白的三级结构（图 6），结果表明MCT包含13个α-螺旋和20个β-片层，有助于理解蛋白质结构与功能之间的相关性。所有已知植物MCT中都具有2个保守的活性位点：（1）底物MEP结合位点；（2）依赖于Mg²⁺的底物CTP结合位点，不同植物来源的MCT在N端非催化区域的氨基酸序列差异很大，在催化区域序列非常保守，萝芙木MCT中，CTP结合位点由Arg99-Lys106组成，MEP结合位点是Arg236-Lys292，由此可以推测胡黄连MCT CTP结合位点和MEP结合位点分别由Arg99-Lys106和Arg236-Lys292组成，CTP和MEP结合位点在一级结构上距离较远，由于MCT全酶结构是一个二聚体，所以2个酶活性中心在一级结构是可能存在距离的^{[20,21,22,23,24,25,26]}。

表 3(Table 3)

表 3 SOPMA对胡黄连MCT二级结构分析 Table 3 Analysis on secondary structure of MCT in P. kurrooa by SOPMA 折叠方式 数目 比例 / % α-螺旋（Hh） 64 20.58 延长带（Ee） 91 29.26 β-转角（Tt） 30 9.65 无规则卷曲（Cc） 126 30.51

表 3 SOPMA对胡黄连MCT二级结构分析 Table 3 Analysis on secondary structure of MCT in P. kurrooa by SOPMA

图 5

Fig. 5

蓝色代表Hh，红色代表Ee，绿色代表Tt，橙色代表Cc Blue one is Hh,Red one is Ee,Green one is Tt,Orange one is Cc图 5 胡黄连MCT二级结构预测 Fig. 5 Secondary structure prediction of MCT in P. kurrooa

图 6

Fig. 6

图 6 胡黄连MCT三级结构预测 Fig. 6 Prediction of three-level structure of MCT in P. kurrooa

通过NCBI网站和生物信息学软件研究胡黄连MCT基因的碱基分布、氨基酸组成，结果发现，该基因中G＋C的碱基量约为37.91%，低于50%，表明发生错配的概率较低，核苷酸处于稳定状态。通过Clustal X等生物信息学软件将胡黄连MCT与其他物种基因序列进行多重性比对和进化分析，序列同源性较高，部分区段同源性达100%，说明其在进化中是十分保守的，也有助于其他物种MCT基因的克隆与分离。这些保守区基因信息为其他物种中该基因的克隆提供了十分有价值的序列信息，为加快基因克隆及MCT基因的分子调控研究奠定基础。较大差异的基因区段可能与基因的进化与变异相关，这些仍待确定。通过NCBI对该基因的蛋白质进行二级和三级结构预测，也有助于未来该基因在生物体内的调控研究。