肿瘤是危害人类的重大疾病之一，近年来，运用中药治疗肿瘤是目前国内外研究的热点^[1]。氧化苦参碱（oxymatrine）是苦参的有效成分，属于四环喹诺里西啶类（quinolizidine）生物碱^[2]，药理和临床研究发现，氧化苦参碱具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、免疫调节等多种药理作用^[3]，并且其抗肿瘤的作用越来越得到重视^[4]。本研究针对氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW620增殖、细胞周期及p16/cyclinD1/CDK4通路调节方面的影响，探讨其对大肠癌可能的作用机制。

人结肠腺癌细胞株SW620为南方医科大学中医药学院药理实验室所存。氧化苦参碱（质量分数≥98%）由宁夏盐池县医药公司提供，批号080630；5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液由上海旭东海普药业生产，批号100108。新生胎牛血清购自杭州四季青公司；0.25% Trypsin、RPMI 1640培养基购于吉诺公司；噻唑蓝（MTT）购于Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO）购于A1Tlresco公司。细胞周期检测试剂盒购于碧云天公司；兔抗p16、cyclinD1、CDK4及β-actin一抗与兔二抗均购自美国Sigma公司。

SW620细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5 %CO₂孵箱中培养，待细胞生长到80%～90%，弃除培养液，PBS轻轻洗涤细胞2、3次，用0.25%胰酶消化3～5 min，终止消化后，RPMI 1640培养液重悬细胞，并按1∶3的比例进行传代，分别接种至表面积为25 cm²的培养瓶中，移入37 ℃、5%CO₂孵箱中培养^[5]。

调整细胞悬液浓度至2×10⁵/mL，取100 μL的细胞悬液接种于96孔培养板中，37 ℃、5%CO₂培养箱孵育，培养至细胞贴壁单层铺满孔底。对照组加入同样量的培养液200 μL，阳性对照组加入终质量浓度为4 mg/L的5-Fu，氧化苦参碱设1、2、4、8、16、32 μmol/L 6个浓度，每组设3个重复孔，药物分别作用24、48、72 h后，每孔加20 μL（5 mg/mL）MTT，培养4 h后，弃去培养基，加150 mL的DMSO溶液，轻轻振荡约10 min后，酶标仪490 nm测吸光度（A）值，计算细胞增殖率。

细胞增殖率＝A_实验组 / A_对照组

对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，以5×10⁵/mL浓度接种于装有消毒玻片的培养皿中，培养24 h后，更换培养基。实验组加入氧化苦参碱2、4、8 μmol/L，另设对照组。作用24 h后收集细胞爬片，固定后Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察细胞核形态。

细胞处理、分组同“1.4”项。收集培养24 h的所有细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗2次，1 200 r/min离心5 min，吸尽上清液，加入70%乙醇（4 ℃预冷）固定，碘化丙啶（PI）染色30 min。进行流式细胞仪分析，并用MUTCYCLE软件分析细胞周期分布情况。

细胞处理分组同“1.4”项。RNA提取与纯化：在细胞沉淀中加入Trizol试剂1 mL，充分振荡混匀，室温放置5 min，加入氯仿0.2 mL，盖紧盖子，用振荡器振荡15 s，室温孵育2～3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液至新的1.5 mL Eppendorf管中。加与上清液等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20 ℃孵育样品20～30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，75%乙醇（含DEPC水）800 μL洗涤沉淀1次，4 ℃、7 500 r/min 离心5 min，弃乙醇。空气或真空干燥5～10 min（不要完全干燥），加DEPC处理水20～50 μL溶解RNA，-80 ℃保存备用。若长期保存，加入2.5倍体积乙醇，置-80 ℃保存。逆转录反应：取4 μL RNA模板进行逆转录反应，仪器为BIO-RAD定性PCR仪（美国），反应体系按逆转录试剂盒说明书进行。荧光定量PCR反应条件：93 ℃、2 min，93 ℃、15 s，55 ℃、25 s，72 ℃、25 s，共40个循环。PCR引物由上海英俊公司设计合成，具体序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 荧光定量PCR反应引物序列 Table 1 Primer sequence of quantitation RT-PCR by fluorescent 基因 序列 p16 正向 5’-ACCAGAGGCAGTAACCATGC-3’ 反向 5’-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3’ CDK4 正向 5’-CCCGAAGTTCTTCTGCAGTC-3’ 反向 5’-CTGGTCGGCTTCAGAGTTTC-3’ cyclinD1 正向 5’-ACCTGAGGAGCCCCAACAAC-3’ 反向 5’-GCTTCGATCTGCTCCTGGC-3’ β-actin 正向 5’-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’ 反向 5’-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3’

表 1 荧光定量PCR反应引物序列 Table 1 Primer sequence of quantitation RT-PCR by fluorescent

细胞处理分组同“1.4”项。细胞以5×10⁹/L接种至6孔板，按照实验分组进行相应处理后，提取细胞总蛋白，以双辛丁酸（BCA）法进行蛋白定量检测。按每个样品25 μL上样后进行电泳分离蛋白质。电泳结束后，采用半干转法将蛋白质转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脱脂奶粉室温封闭l h后，将一抗与膜4 ℃孵育过夜（抗p16、CyclinD1及CDK4，体积分数为1∶1 000），二抗以1∶10 000室温孵育2～3 h，化学发光法显色成像，分析条带灰度值，检测p16、CyclinD1、CDK4蛋白表达水平。

应用SPSS l3.0软件包进行，多组比较采用One-way ANOVA分析，两组间比较采用t检验，数据均以±s表示。

不同浓度的氧化苦参碱作用于SW620细胞不同时间后对细胞增殖的影响结果见表 2。结果表明氧化苦参碱能显著抑制SW620细胞的增殖，与对照组比较，给药组细胞增殖率显著降低（P＜0.05），并有明显的剂量效应关系，其作用24 h的IC₅₀值为4.02 μmol/L。与5-Fu组比较，氧化苦参碱在浓度为8～32 μmol/L时，对SW620增殖抑制率显著提高（P＜0.05）。

表 2(Table 2)

表 2 氧化苦参碱对SW620细胞增殖的影响 (±s，n=3) Table 2 Effect of oxymatrine on proliferation of SW620 cells (±s，n=3) 组别 剂量 / (μmol∙L-1) 增殖率 / % 24 h 48 h 72 h 对照 — 100.0 100.0 100.0 5-Fu 4 mg∙L-1 47.3±0.9 41.2±1.5 33.3±1.9 氧化苦参碱 1 92.7±0.7 82.1±0.8 70.4±0.8 2 84.4±0.7 69.4±1.7 62.4±0.8 4 64.6±0.9 52.2±0.8 47.4±0.7 8 40.3±1.0*# 32.2±1.0*# 22.1±2.0*# 16 31.3±0.9*# 19.6±0.5*# 15.7±2.4*# 32 25.5±1.9*# 14.6±0.8*# 7.5±0.8*# 与对照组比较：*P＜0.05；与5-Fu组比较：#P＜0.05 *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs 5-Fu group

表 2 氧化苦参碱对SW620细胞增殖的影响 (±s，n=3) Table 2 Effect of oxymatrine on proliferation of SW620 cells (±s，n=3)

氧化苦参碱作用SW620细胞24 h后，细胞经Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察可见SW620细胞核形态出现了明显的改变，见图 1，与对照组比较，药物处理后，细胞皱缩，染色质浓缩边集，形成新月形细胞核。对照组无明显凋亡细胞。随着氧化苦参碱作用浓度增加，细胞核皱缩更明显。

图 1

Fig. 1

图 1 氧化苦参碱对SW620细胞形态的影响 (Hoechst33258染色) Fig. 1 Effectof oxymatrine on morphology of SW620 cells (Hoechst33258 staining)

氧化苦参碱2、4、8 μmol/L作用SW620细胞24 h后，与对照组比较，细胞在G₁期的比例明显增加（P＜0.05、0.01），S期的比例显著降低（P＜0.05、0.01），见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 苦参碱对SW620细胞周期的影响 (±s，n=3) Table 3 Effect of oxymatrine on cell cycle of SW620 cells (±s，n=3) 组别 剂量 / (μmol∙L-1) G1期 / % S期 / % G2期 / % 对照 — 44.52±2.90 46.73±1.68 8.74±1.91 氧化苦参碱 2 64.81±1.21 33.16±0.98 2.03±0.23 4 73.43±1.33** 25.71±1.43** 0.86±0.59 8 83.98±3.20** 15.39±2.94** 0.63±0.30 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group,same as below

表 3 苦参碱对SW620细胞周期的影响 (±s，n=3) Table 3 Effect of oxymatrine on cell cycle of SW620 cells (±s，n=3)

RT-PCR结果显示，p16（INK4A）基因在氧化苦参碱组中表达明显升高，与对照组比较差异显著（P＜0.01），氧化苦参碱8 μmol/L组p16 mRNA表达水平最高；氧化苦参碱组cyclinD1和CDK4 mRNA的表达均下降，与对照组比较差异显著（P＜0.05、0.01），氧化苦参碱8 μmol/L组cyclinD1和CDK4 mRNA水平与对照组比较下降最为显著（P＜0.01），见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 氧化苦参碱对SW620细胞p16、cyclinD1、CDK4 mRNA表达的影响 (±s，n=3) Fig. 2 Effect of oxymatrine on mRNA expression of p16,cyclinD1,and CDK4 in SW620 cells (±s，n=3)

免疫印迹法结果（图 3和表 4）显示，与对照组比较，氧化苦参碱可明显提高SW620细胞内p16蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），氧化苦参碱8 μmol/L组p16蛋白表达水平最高（P＜0.01）；与对照组比较，氧化苦参碱组CyclinD1和CDK4蛋白表达水平均下降（P＜0.05、0.01），氧化苦参碱4 μmol/L组CyclinD1和CDK4蛋白水平下降最为显著（P＜0.01）。

图 3

Fig. 3

图 3 氧化苦参碱对SW620细胞p16、CyclinD1、CDK4蛋白表达的影响 Fig. 3 Effect of oxymatrine on protein expression of p16,cyclinD1,and CDK4 in SW620 cells

表 4(Table 4)

表 4 各组细胞内p16、CyclinD1及CDK4蛋白表达相对量 (±s，n=3) Table 4 Relative quantity of protein expression of p16,cyclinD1,and CDK4 in SW620 cells (±s，n=3) 组别 剂量 / (μmol∙L-1) p16/β-actin CyclinD1/β-actin CDK4/β-actin 对照 — 0.063±0.000 1.652±0.159 1.650±0.120 氧化苦参碱 2 1.014±0.007 0.558±0.005 1.260±0.053 4 0.616±0.013 0.096±0.002** 0.131±0.051** 8 0.314±0.014** 0.120±0.017 0.191±0.025

表 4 各组细胞内p16、CyclinD1及CDK4蛋白表达相对量 (±s，n=3) Table 4 Relative quantity of protein expression of p16,cyclinD1,and CDK4 in SW620 cells (±s，n=3)

大肠癌是全球发病率居第3位的常见肿瘤，近年来其发病率呈逐年上升趋势^[2]。针对大肠癌的化疗方案主要是以5-Fu为主的综合化疗，但存在毒副反应大等缺陷。中药以其独特的抗肿瘤疗效、不良反应少等特点，已成为抗肿瘤研究的热点之一^[6]。氧化苦参碱对SW620结肠癌细胞具有明显的诱导凋亡作用，是很有潜力的抗癌药物。体外实验表明氧化苦参碱对多种肿瘤细胞有抑制或杀伤作用，并能诱导细胞分化和凋亡^[2,4]。本研究发现不同浓度氧化苦参碱（1～32 μmol/L）对结肠癌细胞SW620有不同程度的增殖抑制作用，并有一定的剂量效应关系。通过细胞形态学的观察，氧化苦参碱作用SW620细胞24 h后，可见细胞核固缩、核碎裂、细胞膜起泡等形态。

近年来的研究认为，肿瘤是一类细胞周期性疾病。细胞周期的调节因子中就包括多种癌基因和抑癌基因。在细胞增殖周期中，最主要的调控点是G₁期与S期之间的调控点^[5]。G₁期与S期调控点受控于细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKIs）对细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的正负调节作用，即正常细胞从G₁期向S期的调控需要cyclinDl的正调控和p16的负调控来完成^[7,8]。p16蛋白主要通过与CDK竞争性结合cyclinD，而阻碍其与Cyclin D形成复合物，cyclin D/CDK激酶失活，从而阻止细胞从G₁期进入S期，细胞增殖受抑制^[9,10]。本实验研究表明：流式细胞仪检测发现氧化苦参碱作用SW620 细胞24 h后，在2～8 mmol/L内，细胞的G₁期比例逐渐升高，S期比例明显下降，存在G₁/S阻滞^[11]。通过以上研究结果推测氧化苦参碱主要是通过阻滞SW620细胞G₁期向S期的进程，形成G₁期阻滞，造成G₁期细胞堆积阻滞并阻断细胞的DNA合成和复制，从而影响细胞周期进程，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。RT-PCR及免疫印迹法研究表明，与对照组比较，cyclinDl、CDK4蛋白及mRNA表达均下降。p16蛋白和mRNA表达明显增强。说明氧化苦参碱通过调控了G₁期这些细胞周期正负调节因子表达发挥作用，最终抑制细胞周期进展，而导致肿瘤细胞凋亡。综上所述，氧化苦参碱诱导的SW620细胞凋亡，可能是通过使细胞阻滞G₁期无法完成修复而发挥抗肿瘤作用，其分子机制可能与抑制p16/cyclinD1/CDK4通路有关。