藏药坐珠达西为丸剂剂型，由佐塔、红花、木香、诃子、余甘子、石榴子、安息香、唐古特乌头、马钱子等35味药物组成，功效为疏肝、健胃、清热、愈溃疡、消肿，用于“木布”病迁延不愈、胃脘嘈杂、消化不良、浮肿、水肿等^[1]，为藏药治疗慢性胃炎的常用药物。原制剂标准进行了2项理化反应鉴别和船形乌头薄层鉴别及丸剂的相关检查。马肖等^[2]在此基础上又对熊胆、牛黄、木香、丁香进行了薄层鉴别，对马钱子中的马钱子碱进行了液相定性鉴别，对西红花中的西红花苷I进行了高效液相色谱定量测定。但是该药物组成药味较多，仅依靠少数指标的定量测定难以控制其内在质量。

该药物中诃子在藏药中被视为“药中之王”，具有很好的解毒功效，邪气聚于脏腑的内源性毒性和食物、药物中毒等外源性毒性都能驱解^[3]；余甘子系藏族常用药，能清热凉血、消食健胃，用于血热血瘀、消化不良、腹胀等症^[4]；石榴子能温中健脾，治疗厌食、胃寒、脘胀等症^[5]；此3种药物中均含有没食子酸，可用没食子酸作为三者的综合定量标准。木香中医常用以治疗胃部胀满、呕吐、腹痛和腹泻等消化不良症状，具有芳香健胃、行气止痛的功效，是常用理气药，主要成分为木香烃内酯和去氢木香烃内酯^[6]；红花藏医常用来治疗肝病、血病和进行培元健身，其主要成分有西红花苷I、西红花苷II^[7]；安息香具有开窍醒神、行气活血、镇惊息风等功效，其主要成分有苯甲酸^[8]。在组成坐珠达西的药味中，还含有绿原酸和山柰酚。本研究针对上述8种指标性成分建立的多波长HPLC定量测定方法，并测定了2个厂家，共5个批次（四川阿坝州藏医院：批号20130926、20130823、20130703、20120618；金诃藏药：批号20120612）的样品，为更好地控制该药生产规范提供参考依据。

Waters 2695/2996型高效液相色谱仪，2996PDA检测器，Empower化学工作站；KQ5200E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；Metiler AE240S型电子天平，梅特勒-托利上海有限公司。

对照品没食子酸（批号111109，质量分数≥98.0%），苯甲酸（批号120807，质量分数≥98.0%），木香烃内酯（批号120322，质量分数≥98.0%），去氢木香烃内酯（批号120321，质量分数≥98.0%），西红花苷I（批号120714，质量分数≥98.0%），西红花苷II（批号110925，质量分数≥98.0%），四川省维克奇生物科技有限公司；对照品绿原酸（批号121125，质量分数≥98.0%），山柰酚（批号120718，质量分数≥98.0%），成都普菲德生物技术有限公司。坐珠达西（丸剂）供试品，批号20130926、20130823、20130703、20120618，四川阿坝州藏医院藏医药研究所制；批号20120612，金诃藏药股份有限公司。流动相甲醇为色谱纯（Oceanpak公司），提取用甲醇为分析纯（质量分数≥99.5%，成都市科龙化工试剂厂），磷酸为分析纯（质量分数≥85.0%，成都市科龙化工试剂厂），水为纯净水。

Kromasil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱：0～8 min，13%～20% A；8～20 min，20%～38% A；20～30 min，38%～50% A；30～45 min，50%～70% A；45～65 min，70%～80% A；体积流量为1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯检测波长为225 nm，绿原酸检测波长为352 nm，西红花苷I和西红花苷II检测波长为455 nm。按照上述色谱条件进行测定，各组分间分离度良好，对照品及样品的色谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

A1～A3-对照品 B1～B3-样品 1-没食子酸 2-绿原酸 3-苯甲酸 4-山柰酚 5-木香烃内酯 6-去氢木香烃内酯 7-西红花苷I 8-西红花苷II，图 4同 A1—A3-reference substances B1—B3-sample 1-gallic acid 2-chlorogenic acid 3-benzoic acid 4-kaempferol 5-costunolide 6-dehydroepiandrosterone costunolide 7-crocin I 8-crocin II,Fig. 4 is same图 1 对照品和样品HPLC图 Fig. 1 HPLC of reference substances and samples

取没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯适量，精密称定，加甲醇分别制成含1.012、1.102、1.016、1.080、1.004、1.098 mg/mL的溶液；再取西红花苷I、西红花苷II适量，精密称定，加稀乙醇分别制成含1.070、1.064 mg/mL的溶液，即得各对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各2.7、1.3、0.9、1.7、3.5、3.0、0.5、0.2 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。

取坐珠达西粉末1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密封，称定质量，超声提取30 min。冷却至室温后称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

将“2.2”项下混合对照品溶液依次稀释1、2、4、8、16倍，分别精密吸取不同倍数和原混合对照品溶液10 μL进样，以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到线性回归方程及相关系数，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 对照品的线性关系和范围 Table 1 Linearities and ranges of reference substances 化合物 回归方程 r 线性范围 / μg 没食子酸 Y＝5.8×107 X＋2×105 0.999 6 34.156～1 093 绿原酸 Y＝1.4×107 X＋60 625 0.999 8 17.906～573 苯甲酸 Y＝6.8×107 X＋72 302 0.999 6 11.438～366 山柰酚 Y＝4.0×107 X＋74 794 0.999 7 22.938～734 木香烃内酯 Y＝1.8×106 X＋19 255 0.999 8 50.188～1 606 去氢木香烃 内酯 Y＝1.4×107 X＋54 205 0.999 8 41.094～1 315 西红花苷I Y＝7.3×107 X＋64 046 0.999 9 6.688～214 西红花苷II Y＝8.0×107 X＋37 398 0.999 8 2.656～85

表 1 对照品的线性关系和范围 Table 1 Linearities and ranges of reference substances

精密吸取“2.2”项下稀释1倍的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，每次10 μL，记录峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、西红花苷I和西红花苷II峰面积的RSD分别为0.89%、0.49%、0.87%、0.93%、0.42%、0.44%、0.72%、0.58%，表明仪器精密度良好。

取同一份坐珠达西样品（批号20130703）粉末6份，按“2.3”项下确定的方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析。结果显示没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、西红花苷I和西红花苷II质量分数的RSD分别为0.73%、1.99%、2.23%、1.12%、1.68%、2.19%、2.11%、2.07%，表明该方法重复性良好。

取一份坐珠达西样品（批号20130703）粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h时进样10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行分析，计算各成分峰面积的RSD。结果显示供试品溶液中没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、西红花苷I和西红花苷II峰面积的RSD分别为1.85%、2.02%、2.65%、3.32%、3.76%、1.38%、3.49%、2.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

称取已测定的坐珠达西样品（批号20130703）粉末6份，每份约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入各对照品溶液（使得对照品量相当于样品中相应成分量的50%～120%）适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各对照品的回收率和RSD，结果没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、西红花苷I和西红花苷II的平均加样回收率为100.17%、97.99%、101.42%、100.54%、99.13%、99.82%、98.11%，97.13%，RSD为2.1%、2.9%、5.2%、4.2%、3.3%、5.3%、2.0%、3.4%。

取各批次的坐珠达西样品粉末，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，每个样品平行2份，并按“2.1”项下的色谱条件进行测定，每份测定2次，计算各样品中没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、西红花苷I和西红花苷II的量，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 5批样品中8种成分的测定 (n＝4) Table 2 Contents of eight constituents in five batches of samples (n＝4) 批号 进样序号 厂家 质量分数 / (mg∙g-1) 没食子酸 绿原酸 苯甲酸 山柰酚 木香烃内酯 去氢木香烃内酯 西红花苷I 西红花苷II 20130926 1～4 阿坝州藏医院 0.672 0 0.181 7 0.157 7 0.729 0 2.156 9 1.621 5 0.045 8 0.030 2 20130823 5～8 阿坝州藏医院 0.763 4 0.227 0 0.151 3 0.689 4 2.527 2 1.533 2 0.052 4 0.023 8 20130703 9～12 阿坝州藏医院 0.742 1 0.170 9 0.146 1 0.629 5 1.717 8 1.525 2 0.045 1 0.026 0 20120618 13～16 阿坝州藏医院 1.129 5 0.165 1 0.095 0 0.399 2 0.177 0 0.801 3 0.022 4 0.010 4 20120612 17～20 金诃藏药 1.192 3 0.118 4 0.682 7 0.535 3 1.403 4 1.888 0 0.366 6 0.159 6

表 2 5批样品中8种成分的测定 (n＝4) Table 2 Contents of eight constituents in five batches of samples (n＝4)

参考文献方法^[9]，以上述测定的8个成分质量分数为数据库。以SIMPCA-12.0软件进行PCA和偏最小二乘法（PLS）分析。坐珠达西样品HPLC的PCA打分图见图 2，聚类分析（HCA）对PCA进行聚类分析柱状图见图 3，荷载图见图 4。结果显示：图 2和图 3中坐珠达西样品清晰地聚为2大类，阿坝州藏医院产样品聚为1类，金诃藏药产样品聚为1类；同时四川产样品不同批次间又分2组。图 4表明本实验中用于定量测定的8个指标峰对坐珠达西内在质量贡献较大。

图 2

Fig. 2

图 2 样品的PCA图 Fig. 2 PCA plot of samples

图 3

Fig. 3

图 3 坐珠达西样品PCA打分图的HCA分析图 Fig. 3 HCA analysis by PCA scores of Zuozhudaxi samples

图 4

Fig. 4

图 4 坐珠达西样品的PCA荷载图 Fig. 4 PCA plot of Zuozhudaxismaples

本研究建立了同时测定藏药坐珠达西中8种成分的HPLC方法，并测定了2个厂家5批10个样品中的8种成分。该方法简单准确，具有较好的重复性和稳定性。

采用PDA二极管阵列检测器，分别对8种成分在190～700 nm进行全波长扫描。结果显示没食子酸、绿原酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、西红花苷I和西红花苷II分别在210、352、230、204、225、225、455、455 nm处有最大吸收。为了兼顾8种成分的最大吸收波长，同时降低工作量，经多次实验验证最终确定没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯5个样品的检测波长为225 nm，绿原酸的检测波长为352 nm，西红花苷I和西红花苷II的检测波长为455 nm。

本研究分别考察了甲醇超声提取，甲醇回流，甲醇回流后酸解3种提取方法对坐珠达西样品中8种成分提取效果的影响，结果以甲醇超声提取的效果最好，加热回流和加酸对样品中的8种成分都有一定的破坏作用，最终确定采用甲醇25 mL超声提取30 min作为供试品溶液的制备方法。

分别考察了乙腈-0.05%磷酸水溶液和甲醇- 0.05%磷酸水溶液2种流动相，结果显示乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相时杂峰很多且多拖尾现象，严重影响8种成分的检测，甲醇-0.05%磷酸水溶液作为流动相上述现象较为缓和，最终选择甲醇- 0.05%磷酸水溶液进行优化作为洗脱流动相。

本研究以所测8个成分为数据库进行了聚类分析，结果显示青海产样品和四川产样品各聚为一类，同时四川产样品又分为2组，表明四川和青海2个厂家内在质量差异较大；同一厂家不同生产年生产的坐珠达西内在质量差异也较大。由于坐珠达西生产工艺较为一致，因此说明不同地区的厂家和批次生产过程中，原药材料的质量控制和生产工艺的控制存在较大的波动，这可能是由于不同地区的藏药厂在生产过程中，使用了同物异名、或不同采收季和生产年限的原药材所致，需要进一步完善原药材和成品的质量标准。

同时经打分图分析可知，本实验中用于测定的8个指标峰对坐珠达西内在质量贡献较大，而其中以峰1（没食子酸）、峰3（苯甲酸）、峰4（山柰酚）、峰6（去氢木香烃内酯）和峰8（西红花苷II）对坐珠达西的质量贡献尤为明显。上述分析表明8个指标成分的定量测定有助控制坐珠达西的内在质量。