补骨脂与肉豆蔻作为温肾暖脾，涩肠止泻药对配伍，最早出自宋•许叔微的《普济本事方》，时称“二神丸”（补骨脂、肉豆蔻2药为主，大枣、生姜为辅）^[1]。补骨脂、肉豆蔻药对自建方始，其主证为全不进食，病位在脾肾二脏，病因病机为“肾气怯弱，真元衰劣，自是不能消化饮食……”。中药是典型的复杂体系，具有多组分与多靶点的特点，在目前对其临床疗效了解较多而作用机制尚未完全明了的情况下，单独依靠一两个指标化合物的定量测定来评价中药的提取工艺是不全面的，中药指纹图谱是目前公认的一种综合的、可量化的质量控制手段，可用于掌握中药多成分的信息。补骨脂素、异补骨脂素均为补骨脂的有效成分，去氢二异丁香酚为肉豆蔻的有效成分。参考相关文献资料^[2,3,4]，本研究以HPLC指纹图谱特征峰面积、补骨脂素、异补骨脂素及去氢二异丁香酚的量以及干浸膏得率为指标，采用正交试验法优选补骨脂-肉豆蔻药对的醇提工艺。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器，二元高压梯度泵，柱温箱，美国安捷伦公司；RE—852旋转蒸发器，巩义市峪予华仪器厂；HH—S型电热恒温水浴锅，江苏省医疗器械厂；TF—18通风橱；KMD型调温电热套，金坛市荣华仪器制造有限公司；BP211D电子分析天平，德国赛多利斯公司；D2F—6020真空干燥箱，上海博讯医疗设备厂；KQ3200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器厂；101A—S1型数显电热鼓风干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司。

对照品补骨脂素（批号110739-201115）、异补骨脂素（批号110738-201012）、去氢二异丁香酚（批号111838-201001）均购于中国食品药品检定研究院，上述对照品质量分数均≥99.3%，均为定量测定用；中药饮片均由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任药师鉴定，分别为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果实、肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt. 的干燥种仁。0.22 μm微孔滤膜，上海陆纳生物科技有限公司；甲醇，色谱纯，美国Tedia公司；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备

称取本药对药材9份，每份称取补骨脂24 g、肉豆蔻12 g，按表 1所列条件制备样品，所得提取液浓缩定容至50 mL量瓶中，精密吸取醇提浓缩液各5 mL分别置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，分别转移至10 mL量瓶中，甲醇定容，超声30 min，分别编号为供试品溶液1～9号，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚对照品适量，分别加甲醇配制成含补骨脂素0.109 mg/mL、异补骨脂素0.112 mg/mL、去氢二异丁香酚0.042 mg/mL的对照品溶液。

2.3 补骨脂素、异补骨脂素定量测定 2.3.1 色谱条件

Welch material Inc C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（50∶50）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为246 nm^[7]。HPLC色谱图见图 1。

2.3.2 阴性对照溶液的制备

根据药对组成，取肉豆蔻药材，按“2.2”项下方法制得阴性对照溶液。

2.3.3 线性关系的考察

自动进样对照品溶液各1、2、4、8、12、16 μL，以色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），绘制标准曲线并进行线性回归。补骨脂素回归方程Y＝767.94 X－13.07，r＝0.999 9；异补骨脂素回归方程Y＝831.23 X－21.87，r＝0.999 9；结果表明，补骨脂素、异补骨脂素分别在0.109～1.744、0.112～1.792 μg呈良好的线性关系。

2.3.4 样品测定

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，计算补骨脂素、异补骨脂素的量。

2.4 去氢二异丁香酚的测定 2.4.1 色谱条件

Agilent Edipse Plus C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（75∶25）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为274 nm。HPLC色谱图见图 2。

2.4.2 阴性对照溶液的制备

根据药对的组成，取补骨脂药材，按“2.2”项下方法制得阴性对照溶液。

2.4.3 线性关系的考察

自动进样对照品溶液各2、4、8、16、24、28 μL，以色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），绘制标准曲线并进行线性回归。去氢二异丁香酚回归方程Y＝169.07 X＋18.85，r＝0.999 9；结果表明，去氢二异丁香酚在0.084～1.176 μg呈良好的线性关系。

2.4.4 样品测定

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，计算去氢二异丁香酚的量。

2.5 指纹图谱 2.5.1 色谱条件

Welch material Inc C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水，采用梯度洗脱：0～15 min，50%甲醇；15～85 min，50%～90%甲醇；85～90 min，90%～50%甲醇；90～95 min，50%甲醇；体积流量1.0 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃；检测波长为234 nm。

2.5.2 方法学考察

（1）精密度试验：取1号供试品，分别按“2.6.1”项下色谱条件连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.05%～0.32%、0.63%～1.55%，均符合指纹图谱的技术要求，表明仪器精密度良好。

（2）稳定性试验：取1号供试品分别按“2.6.1”项下色谱条件在0、4、8、12、24 h进样测定，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.12%～0.60%、0.13%～2.02%，均符合指纹图谱的技术要求，表明稳定性良好。

（3）重复性试验：取补骨脂、肉豆蔻药材，按“2.2”项下方法平行制备1号供试品6份，分别按“2.6.1”项下色谱条件操作，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.41%～1.78%、0.83%～2.45%，均符合指纹图谱的技术要求，表明此方法重复性良好。

2.5.3 测定法

取“2.2”项下处理的1～9号供试品液，按“2.5.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。

2.6 干浸膏得率的测定

取正交试验提取液，摇匀，分别精密量取1～9号浓缩液20 mL，置于对应干燥至恒定质量的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算提取液的总浸膏量。

2.7 正交试验法

正交试验设计根据相关文献报道^[5,6]和预试验。以乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，以HPLC指纹图谱特征峰总面积和补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚质量浓度以及干浸膏得率为指标，在平行操作条件下，按L₉(3⁴) 正交表进行试验，优选醇提最佳工艺条件。各因素水平见表 1。试验安排及结果见表 2。HPLC指纹图谱见图 3，确定了14个特征峰。将指纹图谱中的特征峰面积之和进行统计，结果见表 3。

指标数据进行加权评分方法，综合评分＝补骨脂素质量分数评分＋异补骨脂素质量分数评分＋去氢二异丁香酚质量分数评分＋干膏得率评分＋总峰面积。

补骨脂素质量分数评分＝补骨脂素质量分数/最大补骨脂素质量分数×100×0.05

异补骨脂素质量分数评分＝异补骨脂素质量分数/最大异补骨脂素质量分数×100×0.05

去氢二异丁香酚质量分数评分＝去氢二异丁香酚质量分数/最大去氢二异丁香酚质量分数×100×0.05

干膏得率评分＝干膏得率/最大干膏得率×100× 0.25

总峰面积评分＝总峰面积/最大总峰面积×100×0.6

2.8 正交试验结果的分析

以多指标实验公式法统计分析P值为考察指标，由表 2中极差R值大小显示，各因素作用主次为A＞D＞B＞C；由表 4中方差分析结果表明：因素A具有显著性差异，由表 4可知B、C、D 3因素差异无统计学意义，为降低乙醇消耗和指标成分尽量提取充分，综合评判最佳提取工艺以A₁B₁C₃D₃组合为佳，即最佳工艺条件为乙醇体积分数50%，乙醇6倍用量，每次提取2 h，提取3次。

2.9 验证试验

为了验证上述结果的准确性，保证提取工艺的合理可行，按已确定的最佳提取工艺条件进行3次重复实验，结果提取液中补骨脂素质量浓度分别为0.238 0、0.239 5、0.242 5 mg/mL；异补骨脂素质量浓度分别为0.184 0、0.190 2、0.182 6 mg/mL；去氢二异丁香酚质量浓度分别为0.213 4、0.210 9、0.226 0 mg/mL；干膏得率分别为17.53%、17.40%、17.66%，总峰面积分别为130 085.80、129 855.70、129 625.60，该工艺的综合评分为95.6%。实验证明，优化的提取工艺方法稳定可靠，合理可行，具重复性和可操作性。

3 讨论

在多指标综合评定优化提取工艺过程中，根据各指标在工艺提取选择中的地位，给予不同的加权系数。处理数据采用加权综合评分法，由于补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚在总面积峰中均有体现，故采用较小的加权比重。

吸取上述药对样品溶液5μL进样，利用DAD检测器进行全波段扫描检测分析，结果表明，该样品分别在225、234、265、274 nm检测处都有比较显著的特征色谱峰，其中又以234 nm为检测波长时所得色谱图指纹信息最多，各色谱峰分离度较好，色谱峰的形状也好。因此，本实验选取234 nm作为检测波长。

本实验以总峰面积为指标既能体现中药复方多成分、多靶点的特点，又能降低单一或多个成分作为指标引起的实验误差。采用正交试验结合HPLC指纹图谱法优选补骨脂-肉豆蔻药对醇提工艺，从多方面、多指标对醇提工艺进行整体评价，较单独正交试验优选工艺更具科学性，但特征峰所对应成分的药效作用尚未建立相关性联系，在未来工作中，有待于结合先进的药效组分提取与检测手段及药效学想法追踪该药对的药物活性成分，进一步确定该药对的活性成分^[8,9]。

药对是联系中药和方剂的桥梁，中药药对的现代研究包括：药对功效的研究、药对成分的研究、药对剂量配比的研究、药对在全方中的作用研究。本实验则为药对成分研究初步奠定基础。