葫芦素C（cucurbitacin C）为葫芦烷型四环三萜类化合物，在自然界中很少被发现，目前仅在葫芦科甜瓜属植株黄瓜Cucumis sativus L. 以及Cucumis prophetarum L. 中被发现。葫芦素C是黄瓜植株中的苦味成分，同时也是评价黄瓜品质的指标之一。并不是每一种黄瓜植株都具有苦味，只有含有葫芦素C的黄瓜植株才有苦味^[1,2]。葫芦素C具有杀灭二斑叶螨以及抑制Phytophtora cactorium生长的作用^[3,4]。葫芦素类化合物具有抗癌、抗炎等药理作用^[5]，同时葫芦素C与葫芦素B（cucurbitacin B）具有相似的结构，葫芦素B具有抗肿瘤、增强免疫力、保肝作用^[1,6]。葫芦素B已经被开发成为抗肝癌药物——葫芦素片。因此，葫芦素C具有潜在的药用价值。但是葫芦素C的药理作用很少被研究，原因之一就是很难获得一定量的葫芦素C单体化合物。所以，对黄瓜植株中葫芦素C代谢分布及其在植物体内稳定性研究能够为大量葫芦素C单体化合物的获得提供依据。 1 仪器与试药

HPLC-Q-TOF-MS（美国Agilent公司）；Milli-Q Advantage A10系统（美国MILLPORE公司）；MJ33快速水分测定仪（瑞士Matter Toledo）；ML204/02型精密天平 [梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司]；KQ5200DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；DHG—9246A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；乙腈（德国Merck公司）；甲醇（分析纯，国药集团）；葫芦素C对照品（质量分数为98.4%）由国家中药材生产（湖南）技术中心提取分离得到；黄瓜植株采自湖南省农业科学研究院黄瓜种植基地。 2 方法与结果 2.1 色谱与质谱条件

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～18 min，5%～29% A，18～34 min，29%～39% A，34～40 min，39%～95% A）；柱温30 ℃；检测波长230 nm；体积流量1 mL/min；进样量10 μL。色谱图见图 1。

图 1 葫芦素C对照品 (A)、嫩黄瓜叶 (B) 和黄瓜 (C) 的HPLC图Fig. 1 HPLCof reference substance (A),fresh cucumber leaves (B),and fruits (C)

质谱条件：ESI离子源，采用正离子检测模式；干燥气温度：300 ℃；干燥气体积流量：8 L/min；雾化气压力：3.8×10⁶ Pa；鞘气温度：350 ℃；鞘气体积流量：12 L/min；毛细管电压：3 500 V；锥孔电压：100 V；扫描范围m/z 120～1 200；二级裂解电压为30 eV。 2.2 对照品溶液的制备

精密称取葫芦素C对照品21 mg，置100 mL避光量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容，得到质量浓度为0.21 mg/mL的对照品溶液，待用。 2.3 供试品溶液的制备

将黄瓜植株各部位分开并用粉碎机打碎，精密称定黄瓜植株各部位的粉碎样品约1.0 g于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，取一定量提取液过0.22 μm微孔滤膜，待用。 2.4 线性关系考察

精密量取0.2、1、2、4、6、8、10、16 mL的对照品溶液，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。按照上述色谱条件，分别进样10 μL，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标（Y）、葫芦素C的质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，计算得回归方程Y＝5.433 8 X－0.456 9，r＝0.999 9。结果表明葫芦素C质量浓度在0.42～33.6 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。 2.5 精密度试验

取黄瓜植株粉碎的鲜嫩叶，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，6次峰面积的RSD值为0.31%。 2.6 稳定性试验

取黄瓜植株粉碎的鲜嫩叶，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，分别在0、1、2、4、8、10、24 h进样测定，测得鲜嫩叶中葫芦素C峰面积积分值的RSD为0.50%。结果表明其在24 h内稳定。 2.7 重复性试验

取黄瓜植株粉碎的鲜嫩叶制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下分别测定，测得葫芦素C质量分数的RSD值为0.55%。 2.8 加样回收率试验

取葫芦素C量已测定的黄瓜植株鲜嫩叶6份，每份约1.0 g，精密称定于具塞100 mL锥形瓶中，于每份中加入对照品溶液3.5 mL，再加入甲醇46.5 mL，称质量，密封，超声提取60 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，取一定量溶液过0.22 μm微孔滤膜，在上述色谱条件下测定，平均加样回收率为94.92%，RSD值为0.45%。 2.9 样品测定 2.9.1 黄瓜植株不同部位中水分的测定

分别取黄瓜植株鲜嫩叶，室温阴干2、4、6、8 d的叶、枯萎叶、叶柄、1/3藤（上）、1/3藤（中）、1/3藤（下）、茎须、瓜、根、雌花的粉碎样品各2份，每份约2.0 g，在梅特勒-托利多MJ33快速水分测定仪上测定各部位的水分量。 2.9.2 黄瓜植株不同部位中葫芦素C量的测定

分别取同一黄瓜植株的鲜嫩叶、枯萎叶、叶柄、1/3藤（上）、1/3藤（中）、1/3藤（下）、茎须、瓜、根、雌花等部位的粉碎样品各2份，每份约1.0 g，按照“2.3”项下方法，并按照上述色谱条件进行测定，结合不同部位的水分数据，分别计算不同部位黄瓜植株中葫芦素C的折干量，结果表明，新鲜叶、枯萎叶、1/3藤（上）、1/3藤（中）、1/3藤（下）、茎须的折干葫芦素C的量分别为795.8、 145.7、320.5、89.2、55.0、103.4 μg/g；其他部位未检出。 2.9.3 黄瓜鲜嫩叶烘干过程中葫芦素C量的变化

将同株黄瓜鲜嫩叶摘下，混合均匀，取一定量的叶粉碎，精密称取约1.0 g的粉碎样品6份，放于100 ℃的烘箱中，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、4 h时从烘箱中取出一份。按照“2.3”项制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，结合鲜嫩黄瓜叶的水分数据，分别计算100 ℃烘干0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h后黄瓜叶中葫芦素C的折干量，结果见图 2。

图 2 不同的烘干时间下鲜嫩黄瓜叶中葫芦素C的量变化Fig. 2 Content variation of cucurbitacin C in fresh cucumber leaves dried with various hours

将同株黄瓜鲜嫩叶摘下，混合均匀，摊开放于室温下。分别于0、2、4、6、8 d取一定量的黄瓜叶，打碎，精密称取约1.0 g。按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，结合鲜嫩黄瓜叶的水分数据，分别计算室温下阴干0、2、4、6、8 d后黄瓜叶中葫芦素C的折干量，结果见图 3。

图 3 不同的阴干时间下鲜嫩黄瓜叶中葫芦素C的量变化 Fig. 3 Content variation of cucurbitacin C in fresh cucumber leaves dried with different days in room temperature

鲜嫩黄瓜叶在室温阴干的过程中，葫芦素C的量不断的下降，造成这种现象的原因可能是葫芦素在酶或者微生物的作用下转变成其他物质。利用HPLC-Q-TOF-MS 来分析葫芦素C的转化。鲜嫩黄瓜叶及不同的阴干时间数黄瓜叶的总离子流图见图 4。随着黄瓜叶阴干天数的增加，其水分量不断减少。从而使不同阴干时间相同质量黄瓜叶的总离子流图不具有可比性。所以，为了使总离子流图的峰面积具有可比性，将样品总离子流图的峰面积全部折算成1.0 g 干质量黄瓜叶的峰面积进行比较。比较发现化合物1（图 4-E）的峰面积不断上升，化合物1的一级质谱数据分别为723.385 7 [M＋H]⁺，740.418 3 [M＋NH₃]⁺，745.374 6 [M＋Na]⁺，葫芦素C的一级质谱数据分别为561.339 9 [M＋H]⁺，578.368 3 [M＋NH₃]⁺，583.321 9 [M＋Na]⁺。葫芦素C的相对分子质量为560，因此可以得出化合物1的相对分子质量为722，化合物1的相对分子质量比葫芦素C多162。化合物1与葫芦素C的碎片离子几乎一致，说明化合物1是在葫芦素C的骨架上链接了一个葡萄糖分子。由于在二级质谱中，糖苷键极易断裂而使化合物1失去一分子葡萄糖而转化成葫芦素C，但是利用质谱无法推断葡萄糖与葫芦素C糖基化的位置。根据文献报道^[1]，葫芦素C 3位羟基最容易糖基化，因此将化合物1初步鉴定为3-葡萄糖基-葫芦素C。

图 4 阴干0 (A)、2 (B)、4 (C)、6 (D)、8 (E) d 黄瓜叶的总离子流图Fig. 4 TICsof cucumber leaves dried in room temperature for 0 (A),2 (B),4 (C),6 (D),and 8 (E) d

3-葡萄糖基-葫芦素C很容易失去一分子葡萄糖而形成葫芦素C的碎片，葫芦素C的碎片因25位存在乙酸基团，因此容易失去一分子乙酸而形成m/z为501的碎片峰。3-葡萄糖基-葫芦素C分子中存在多个羟基，在质谱裂解中很容易失去一分子或者多分子H₂O而形成m/z为645 ,483,465,447的碎片峰。因11位存在羰基，很容易发生麦氏重排反应，从而失去CH₂O基团而形成m/z为471，453的碎片峰。在质谱裂解的过程中，17位与22位的化学键容易断裂从而使3-葡萄糖基-葫芦素C容易失去侧链从而形成m/z为139，67的碎片峰，m/z为139的碎片峰发生分子内重排，即20位上的甲基以及羟基上的氢重排到22位的羰基上从而使20位形成羰基，20位的羰基发生α裂解而失去一分子CO而形成m/z为111的碎片^[7,8]。 3 讨论

黄瓜植株中鲜嫩叶葫芦素C的量最高，但是随着叶变枯萎葫芦素C的量下降。黄瓜叶是由黄瓜的子叶发育而来，在子叶发育的第6天葫芦素C的量达到最大值，而随后其量开始下降。所以黄瓜植株鲜嫩叶中葫芦素C的量最高，随着叶变老其量下降。出现这种现象有2种可能的原因：其一，可能是随着黄瓜植株的生长，葫芦素C由黄瓜叶中转移到其他部位储存起来；其二，葫芦素C本身不能稳定存在于黄瓜植株中，可能在各种酶的作用下转变成为更为稳定的化合物；将黄瓜藤按长度平均分成3截，对每一截进行分析得知，最上面1/3黄瓜藤中葫芦素C量最高，中间的1/3其次，最下面1/3黄瓜藤量最低。黄瓜藤自上而下葫芦素C的量不断下降，根部检测不到葫芦素C。黄瓜叶柄，雌花以及黄瓜中均未检测到葫芦素C。从以上分析可知：黄瓜植株中葫芦素C主要分布在鲜嫩的叶与鲜嫩的藤中。

从图 2可以看出鲜嫩黄瓜叶在100 ℃的烘箱中0.5 h后，葫芦素C的量下降了73.0%，4 h后下降了83.1%。从图 3中可以看出，鲜嫩黄瓜叶在室温下放置2 d后，葫芦素C的量下降了46.9%，放置8 d后，葫芦素C的量下降了72.2%。因此，在黄瓜植株中鲜嫩黄瓜叶是获取葫芦素C最好的原料，阴干或者烘干均会造成葫芦素C的大量损失。

无论是室温下阴干还是在100 ℃的烘箱中烘干，鲜嫩黄瓜叶中葫芦素C的量均明显下降。但是在实验中发现葫芦素C单体化合物在室温或者甲醇溶液中均能稳定存在，说明因采摘而被强行终止代谢的鲜嫩黄瓜叶，因酶或者微生物而使葫芦素C不能稳定存在。HPLC-Q-TOF-MS分析结果表明，在阴干的过程中葫芦素C可能转化成为葫芦素苷，初步鉴定为3-葡萄糖基-葫芦素C。而烘干过程中葫芦素C的转化有待进一步研究。