芍药Paeonia lactiflora Pall. 为芍药科芍药属芍药组多年生宿根草本植物，除具观赏价值外，芍药还有重要的药用价值，是我国传统常用中药材^[1]。根据加工方式的差别，可将其分为赤芍和白芍，赤芍Paeoniae Rubra Radix为芍药或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根，白芍Paeoniae Alba Radix为芍药栽培品种去皮水煮后的干燥根^[2]。二者均含有芍药苷（paeoniflorin）、芍药内酯苷（albiflorin）、羟基芍药苷（oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药苷（benzoylpaeoniflorin）等双环单萜类蒎烯型化合物^[3]。芍药苷是赤芍和白芍中具药用价值的主要药效成分，也是其质量指标成分^[2]，具有免疫调节、镇痛、镇静、解痉、保肝、扩张血管和抗炎等作用^[4]。芍药苷在芍药各部位分布差异明显，在芍药根中富含芍药苷^[5]，根或根茎是《中国药典》2010年版中规定的能够加工为赤芍或白芍的原料^[2]。研究表明芍药苷在芍药新鲜的叶和茎中已经存在，推测芍药苷在叶中就已合成，之后经茎运向根部^[5]。对芍药苷的量与采收时期及采收部位关系的研究已较为深入^[5,6]，但由于芍药背景复杂，兼之其基础研究较为薄弱，芍药苷的生物合成及其分子调控机制还知之甚少，亟需应用现代分子生物学手段探明其机制。

肌动蛋白（Actin）是真核生物细胞中普遍存在的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统，参与真核生物细胞的许多重要的生命活动^[7]。迄今为止，已相继从百合^[8]、桑树^[9]、刺五加^[10]、芍药^[11]等高等植物中克隆出Actin cDNA。Actin表达量大且基本恒定，因此在功能基因的表达分析时常作为内标基因，已应用于茶树^[12]、黄瓜^[13]、猕猴桃^[14]、普通菜豆^[15]等多种高等植物功能基因的表达分析研究中。尽管本课题组已经克隆了芍药Actin cDNA，但芍药Actin基因结构仍然未知，无法设计出跨越内含子的半定量RT-PCR扩增引物，从而避免由DNA污染而造成的RT-PCR扩增假阳性^[16,17]。鉴于此，本研究克隆了芍药Actin基因组DNA序列并分析了基因结构，设计了一对RT-PCR扩增引物，其中上游引物跨越了芍药肌动蛋白第1个内含子序列，对Actin基因在芍药不同组织中的表达进行了半定量分析，评价了其作为内标基因的可行性，从而为下一步研究芍药重要功能基因的表达奠定了基础。 1 材料与试剂 1.1材料

芍药栽培品种“桃花飞雪”根、茎、叶、花等新鲜样品采自洛阳市土桥花木种苗有限公司，由卫志鹏业务经理进行品种鉴定，清洗后液氮保存带回实验室，立即置于-80℃冰箱备用；大肠杆菌DH5α菌株由本实验室提供。 1.2 试剂

高保真KOD-Plus DNA聚合酶购自日本TOYOBO公司；DNA凝胶回收试剂盒、克隆载体pMD18-T、质粒提取试剂盒、限制性内切酶BamH I和Hind III购自宝生物工程（大连）有限公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。 2 方法 2.1 芍药总DNA提取

采用改良CTAB法提取芍药根基因组总DNA^[18]，将总DNA质量浓度调至50 ng/μL。 2.2 引物合成

基于本实验室克隆的芍药肌动蛋白cDNA序列（JX310002），利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性PCR扩增引物5’-CGCGGATCCATGGCCGATG-CTGAGGATATCC-3’和5’-CCCAAGCTTTTAAAA-GCACTTCCTGTGGACA-3’，上下游引物分别插入了BamH I和Hind III酶切位点，用于对克隆的阳性重组子进行双酶切鉴定，引物序列由北京华大基因研究中心合成。 2.3 芍药Actin基因的PCR扩增

50 μL PCR扩增体系中含5 μL 10×缓冲液、5 μL 2.0 mmol/L each dNTP、4 μL 25 mmol/L MgCl₂、1.5 μL 10 pmol/μL上下游引物、2.5 μL DNA、1 μL KOD-Plus DNA聚合酶、29.5 μL ddH₂O。PCR扩增程序为94 ℃预变性2 min，98 ℃ 变性10 s，55 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸1 min，共35个循环。 2.4 芍药Actin基因PCR产物的回收、克隆

用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收芍药Actin基因PCR产物，在对其3’末端加A^[19]后与克隆载体pMD 18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后进行菌落PCR初筛，质粒PCR筛选和BamH I和Hind III双酶切进一步鉴定，将阳性重组子送至北京华大基因研究中心测序。 2.5 芍药Actin基因结构分析

应用在线的Augustus软件^[20]（http://bioinf.uni-gre-ifswald. de/augustus/）对芍药Actin基因的外显子和内含子进行初步预测；应用在线的Blastn双序列比对软件对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对芍药Actin cDNA序列（JX310002）和基因组DNA序列（KF363830）进行双序列比对，人工分析剪接位点供位、受位与识别序列等信息，分析芍药Actin的基因结构。 2.6 序列同源性分析及分子进化树构建

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Blastn程序在核苷酸水平上对芍药肌动蛋白进行序列同源性分析；使用MEGA 5.0软件构建分子系统进化树。 2.7 半定量RT-PCR表达分析

基于克隆的芍药肌动动蛋白基因组DNA序列（KF363830），设计一对特异性PCR扩增引物5’-GGAATGGTCAAGGCTGGTTT-3’及5’-TTCTC- TGTTGGCTTTGGGGT-3’用于半定量RT-PCR分析，其中上游引物跨越了芍药Actin基因的第1个内含子，引物序列由北京华大基因研究中心合成。

分别提取芍药“桃花飞雪”根、茎、叶、花等不同组织总RNA^[21]，以等量的RNA反转录为cDNA，取等量cDNA进行半定量RT-PCR扩增。PCR反应体系及PCR扩增程序参照本实验室的方法进行^[11]。 3 结果与分析 3.1 芍药Actin基因的PCR扩增

以芍药“桃花飞雪”芍药基因组总DNA为模板，成功扩增出了大小约1 400 bp的PCR产物（图 1）。

图 1 芍药Actin基因的PCR扩增产物 Fig. 1 PCR amplification products of Actin gene of P. lactiflora 1,2-Actin基因PCR产物 1,2-PCR products of Actin gene

PCR产物经纯化回收、加A后与克隆载体pMD18-T连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，菌落PCR初筛；挑取阳性重组子进行过夜培养，用Takara公司的小提质粒试剂盒提取质粒，质粒PCR鉴定结果表明扩增产物与预测大小相同（图 2），BamH I和Hind III双酶切鉴定结果表明酶切片段大小与预期结果一致（图 3），表明克隆成功，将鉴定的阳性重组子质粒送至北京华大基因研究中心进行测序。

图 2 质粒PCR鉴定重组子Fig. 2 Characterization of recombinants by plasmid PCR 1～3-质粒PCR 产物 1—3-plasmid PCR products

图 3 双酶切鉴定重组子Fig. 3 Characterization of recombinant by double enzyme digestion 1-BamH I 和Hind III 双酶切产物 1-Double digestion products by BamH I and Hind III

结果表明芍药Actin基因组DNA全长1 405 bp，Augustus在线分析及Blastn双序列分析结果表明芍药Actin基因共含4个外显子和3个内含子；4个外显子的核苷酸序列与本实验分离的芍药Actin cDNA序列（JX310002）完全一致；3个内含子中每个供位与受位共6个剪接位点均遵循高等真核生物5’端供位GU与3’端受位AG模式^[22]；4个外显子区域为1～60、172～565、650～1 263和1 340～1 405，3个内含子区域为61～171、566～649和1 264～1 339；共编码377个氨基酸（图 4），GenBank登录号为KF363830。

图 4 芍药Actin基因结构及编码的氨基酸序列Fig. 4 Nucleotide sequences of Actin gene and its encoded amino acids in P. lactiflora

Blastn分析结果表明芍药Actin基因组DNA序列（KF363830）与多种高等植物的Actin基因具有很高的同源性，其中与“红艳争辉”芍药的Actin基因（JN225878）同源性高达99%，二者外显子核苷酸序列仅有3个碱基的差异，但后者仅含有2个内含子，而缺失了长度为111 bp的第1个内含子；与来自拟南芥、桑、毛果杨、大豆、葡萄及棉属多种植物的Actin相似性达83%以上，表明高等植物的Actin在DNA水平上具有较高的保守性。应用MEGA5.0软件对同源性较高的近缘植物的肌动蛋白跨越起始密码子ATG和终止密码子TAA的编码区进行多序列比对并构建分子系统进化树（图 5），结果表明“桃花飞雪”芍药Actin基因与“红艳争辉”芍药Actin基因（JN225878）亲缘关系最近，与桑（Morus alba L.，HM623866）、葡萄（Vitis vinifera L.，AM465189）、大豆 [Glycine max (L.) Merrill，V00450] Actin基因具有相对较近的亲缘关系，与毛果杨（Populus trichocarpa Torr. & Gray，EF418792）、小果白刺（Nitraria sibirica Pall.，AB636284）、拟南芥 [Arabidopsis thaliana (L.) Heynh，ATU41998、ATU42007] Actin基因组成的小进化群体亲缘关系较远，但是由棉属多个物种包括黄褐棉（Gossypium mustelinum Miers ex Watt，JF722026、JF722027）、陆地棉（Gossypium hirsutum L.，JF722036、HQ142999）、海岛棉（Gossypium darwinii Watt，JF722029）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii Ulbrich，HQ142996）、拟似棉（Gossypium barbadense L.，JF722034、HQ142997、HQ142998）、毛棉（Gossypium tomentosum Nuttall ex Seemann，JF722030、JF722031）、达尔文氏棉[Gossypium gossypioides (Ulbrich) Standley，JF722043]、哈克尼西棉 [Gossypium harknessii Brandegee，JF722039]、辣根棉 [Gossypium armourianum Kearn，JF722038]的Actin基因都相对集中地分布在小进化群中，说明棉属植物Actin基因之间的进化可能只是在少数核苷酸产生了突变。由于生理功能的重要性，Actin在自然选择过程中承受着巨大选择压力，因而核苷酸序列表现出高度保守^[8]。

图 5 Actin基因的分子系统进化树 Fig. 5 Molecular phylogenetic tree of Actin gene

基于克隆的芍药肌动蛋白基因组DNA序列（KF363830）设计了一对半定量RT-PCR扩增引物，PCR扩增产物大小约为309个碱基；其中上游引物跨越了第1个内含子，可以有效防止由DNA污染而造成的RT-PCR扩增结果的假阳性。半定量RT-PCR分析表明，Actin基因在芍药根、茎、叶、花中的表达量一致（图 6）；因此Actin基因能够作为芍药功能基因半定量RT-PCR或荧光定量PCR分析的内参基因。

图 6 Actin基因在芍药不同组织中的表达Fig. 6 Expression levels of Actin in different organs

芍药苷属于单萜糖苷，其生物合成通过位于细胞质中的甲羟戊酸（mevalonate pathway，MVA）途径^[23]和位于质体中的脱氧木酮糖-5-磷酸途径（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP）^[24]或甲基赤藓醇-4-磷酸途径（methylerythritol-4-phos-

phate pathway，MEP）两个代谢途径独立合成。其代谢过程可分为中间体异戊烯基焦磷酸（isopentenylpyrophosphate，IPP，C5）及其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP，C5）的生成、直接前体物质的生成和萜类生成及修饰共3个阶段^[25]。高等植物体内IPP形成后，即与其异构体DMAPP各1分子在牻牛儿基二磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）的作用下经头尾缩合生成具C10骨架的牻牛儿基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP）；GPP 在单萜烯合酶（monoterpene synthase）作用下生成单萜烯（monoterpene，C10）^[26,27]，进一步在修饰酶的作用下生成芍药苷。在本研究中，本实验克隆了芍药Actin基因的基因组序列，分析了其基因结构，设计了跨越内含子的半定量RT-PCR引物，可以有效防止由DNA污染而造成的RT-PCR假阳性；半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因可以作为芍药功能基因表达分析的内标基因。下一步本课题组将基于课题组已完成的芍药转录组测序数据，对参与芍药苷代谢的候选基因进行半定量和定量表达分析，以期为阐明芍药苷的代谢及分子调控奠定基础。