龙胆苦苷（gentiopicroside）广泛存在于龙胆科植物中，是滇龙胆Gentiana rigescens Franch. 等药用植物中一类重要的次生代谢产物^[1]，也是龙胆泻肝丸等多种中药产品的主要药效成分^[2]。现代药理学研究证实龙胆苦苷具有保肝、利胆、镇痛、抗炎、抗菌、健胃、抗肿瘤以及诱发神经轴突生长等作用^[3,4,5,6]。龙胆苦苷属于裂环烯醚萜类化合物，同所有的单萜化合物一样起源于相同的底物，即牻牛儿基焦磷酸（GPP，C10），而该化合物的C10骨架由牻牛儿基焦磷酸合成酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）催化异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其异构体二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）头尾缩合而成^[7,8]。GPP能经过多步酶学催化过程随后转换为香叶醇、香叶醇10-羟化酶、马钱苷酸、裂环番木鳖酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷，最后形成龙胆苦苷^[9,10]。GPPS是短链异戊烯基合成酶家族成员，催化1分子的IPP与DMAPP合成GPP，是异戊二烯途径中一个很重要的酶，在吸引传粉者和次生代谢产物的防御中起重要作用^[11]。

Burke等^[12]第一次从薄荷属植物辣薄荷Mentha piperita L. 中分离出2个亚基组成的异型二聚体GPPS蛋白，并从cDNA文库中筛选得到了GPPS基因全长cDNA序列。随后GPPS基因相继从拟南芥Arabidopsis thaliana L.^[13]、啤酒花Humulus lupulus L. ^[14]、长春花Catharanthus Roseus (Linn.) G. Don ^[15]、金鱼草Antirrhinum majus L.^[16]等植物中克隆得到，并发现GPPS分布在叶绿体以及分泌腺细胞中，且以同型二聚体、异质二聚体两种形式存在^[15]。据报道，同聚肽GPPS在2种裸子植物冷杉Abies Grandis Lindl.、挪威云杉Picea abies L. Karst ^[17,18,19]和4种被子植物拟南芥、番茄Lycopersicon esculentum Miller、夏栎Quercus robur L.、蝴蝶兰Phalaenopsis bellina L. 中存在^[8,13,20,21]；杂聚肽GPPS只在被子植物辣薄荷、金鱼草、仙女扇Clarkia breweri、啤酒花中存在^[12,14,16]。在结构上，杂聚肽GPPS包含非催化活性小亚基（SSU）和一个大亚基（LSU），这些亚基在GPPS单独存在时无活性和功能，2种亚基的相互作用导致杂聚肽GPPS的活性^[15]。

滇龙胆为龙胆科龙胆属多年生宿根草本植物，是我国特有物种，主要分布于云南、贵州、四川、广西等省，其中云南是主要产区。野外主要生长在海拔1 100～3 000 m杂木林下、荒坡地、山谷灌木丛旁^[22]。滇龙胆在云南有悠久的药用历史^[23]，被《中国药典》2010年版收录，为传统中药材龙胆的植物来源之一^[24]。目前，国内外对滇龙胆的研究主要集中在栽培、农艺性状、化学成分研究、矿质元素测定等方面^[25,26,27]，而对滇龙胆GPPS基因的扩增和功能分析至今未见报道。本研究根据三年生滇龙胆转录组牻牛儿基焦磷酸合成酶（GrGPPS）基因序列，设计特异性引物，从滇龙胆叶中成功提取到RNA，反转录为cDNA，进而扩增到GrGPPS基因，并进行酶切鉴定、测序以及序列分析，然后进行原核表达。结果表明GrGPPS转化菌在37 ℃、终浓度为1 mmol/L IPTG诱导下成功表达出目的蛋白。本研究为滇龙胆及龙胆科植物中裂环烯醚萜类化合物生物合成途径的研究奠定基础，也为其他生物中GPPS蛋白的研究提供参考。 1 材料和试剂 1.1 材料

滇龙胆Gentiana rigescens Franch. 栽培于云南省农业科学院药用植物研究所种质资源圃（25°08′ 04.50″N，102°46′15.05″E）。栽培地海拔1 942 m，年平均气温14.7 ℃，年平均降水量980～1 050 mm，极端最高温度30.4 ℃，极端最低温度-0.2 ℃。试验材料为滇龙胆长势良好的幼叶。大肠杆菌Escherichia coli Trans 5α和Rosetta（DE3）菌种购于宝生物工程（大连）有限公司。 1.2 试剂

RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue Reagent、反转录试剂盒、限制性内切酶及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG）、X-gal等均为宝生物工程（大连）有限公司产品；高纯质粒小量制备试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；质粒pGEX-4T-1由昆明理工大学生物工程技术研究中心植物组保存；引物由上海捷瑞生物工程技术服务有限公司合成，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 2 方法 2.1 叶片总RNA提取及GrGPPS全长cDNA的克隆

按照RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue试剂盒说明书，提取滇龙胆幼叶的总RNA；按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒说明书合成cDNA，-20 ℃保存备用。根据三年生滇龙胆转录组GrGPPS基因序列和原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点，设计一对特异引物GrGPPSSalI-F：5’-GTCGACATGGCTTTGATATAT- TCTACTCCATC-3’；GrGPPSXhoI-R：5’-CTCGAG-TCAATTATCCCTATAAGCAATGTAATT-3’。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、67 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。 2.2 GrGPPS基因的测序与分析

GrGPPS PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化，纯化后将其连接到pMD19-T载体上，转化E. coli Trans 5α感受态细胞，涂布于添加氨苄青霉素（100 mg/L）、IPTG、X-gal的LB平板上，37 ℃培养12～16 h后随机挑取阳性克隆摇菌后提取质粒，经PCR检测和酶切鉴定正确后进行测序，获得重组载体pMD19T-GrGPPS。 2.3 原核表达载体的构建

对pMD19T-GrGPPS重组质粒和pGEX-4T-1载体分别进行SalI和XhoI双酶切，回收目的基因和载体片段，按摩尔比1∶4混合后经Ligation Solution I 连接后转化E. coli Trans 5α感受态细胞，涂布于添加氨苄青霉素（100 mg/L）的LB平板，次日随机挑取阳性克隆摇菌后提取质粒，经PCR检测和酶切鉴定正确后进行测序，获得融合表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS。 2.4 GrGPPS的生物信息学分析

利用NCBI网站上的BLAST程序进行序列比对，应用DNAMAN软件推测和比对氨基酸序列，并预测蛋白质相对分子质量和等电点等；应用Mega4.0软件构建系统进化树；利用数据库资源http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html进行稀有密码子分析。 2.5 重组质粒pGEX-4T-1-GrGPPS在大肠杆菌中的表达

利用热激法将重组质粒pGEX-4T-1-GrGPPS转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，挑取单菌落接种于4 mL LB液体培养基（含100 mg/L氨苄青霉素）中，37 ℃200 r/min培养过夜。次日以1∶100的比例转接到新的不含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃200 r/min培养至吸光度（A₆₀₀）值0.6～0.8，在37 ℃条件下，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L）进行诱导表达，同时以加入IPTG（终浓度1 mmol/L）的pGEX-4T-1质粒转化菌为对照。诱导0、1、2、4、6和8 h后分别收集菌液2 mL。12 000 r/min常温离心1 min后，弃上清，加入20 μL的5×SDS-PAGE上样缓冲液 [250 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、0.5%溴酚蓝、50%甘油、5% β-巯基乙醇]，100 μL Milli-Q water，震荡混匀，100 ℃煮沸15 min。室温12 000 r/min离心5 min，取20 μL样品上样，进行SDS-PAGE（4%浓缩胶和12%分离胶）电泳检测。 3 结果与分析 3.1 滇龙胆GrGPPS cDNA的克隆

以滇龙胆cDNA为模板扩增出的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增片段在1 100 bp左右，是预期的目的片段（图 1）。重组质粒pMD19T-GrGPPS经酶切验证连接正确，有明显的、单一的目的条带，且目的条带与预期条带的大小吻合（图 1）。测序结果表明GrGPPS（登录号为KF922375）全长1 107 bp。

图 1 RT-PCR扩增GrGPPS基因及双酶切验证Fig. 1 Fragment of GrGPPS amplified by RT-PCR and restriction verification of pMD19-GrGPPSM-Marker 1-GrGPPS扩增产物 2-重组质粒pMD19T-GrGPPS SalI和XhoI双酶切产物 M-Marker 1-PCR product of GrGPPS 2-product of recombinant plasmid pMD19T-GrGPPS digested by SalI and XhoI

利用DNAMAN以及Genetyx软件对GrGPPS的序列进行分析，结果显示GrGPPS基因的开放阅读框（ORF）长1 107 bp，编码369个氨基酸（图 2）。

图 2 GrGPPS的cDNA序列及其预测的编码蛋白质的氨基酸序列Fig. 2 cDNA sequence of GrGPPS and predicted amino acid sequence coding protein

利用GeneBank数据库中的Blastp程序对GrGPPS的氨基酸进行同源性分析，结果表明滇龙胆GrGPPS与金鱼草AmGPPS蛋白的相似性最高，为80%；与辣薄荷MpGPPS和加拿大薄荷McGPPS蛋白序列的相似性最低，为68%（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 GrGPPS氨基酸序列与NCBI中已知植物GPPS序列比对结果 Table.1 BLASTn result of GrGPPS amino acids with other GPPS sequences in plant of NCBI 物种 相似性 / % 基因 登录号 长春花Catharanthus roseus 77 CrGPPS AGL91645.1 金鱼草Antirrhinum majus 80 AmGPPS AAS82860.1 胡黄连Picrorhiza kurrooa 70 PkGPPS AAW66658.1 辣薄荷Mentha piperita 68 MpGPPS AAF08793.1 啤酒花Humulus lupulus 69 HlGPPS ACQ90682.1 加拿大薄荷Mentha canadensis 68 McGPPS ABR15420.1 丹参Salvia miltiorrhiza 77 SmGPPS AEZ55681.1 芒果Mangifera indica 75 MiGPPS AFJ52722.1

表 1GrGPPS氨基酸序列与NCBI中已知植物GPPS序列比对结果 Table.1 BLASTn result of GrGPPS amino acids with other GPPS sequences in plant of NCBI

利用Mega4.0将GrGPPS氨基酸序列与从NCBI中挑选的同源性较高的部分已知序列进行系统进化分析，结果表明滇龙胆GrGPPS与长春花CrGPPS在同一进化枝上（图 3），表明其亲缘关系较近；与芒果MiGPPS、啤酒花HlGPPS的遗传距离较远（图 3），表明滇龙胆GrGPPS与芒果MiHPPS、啤酒花HlGPPS的亲缘关系较远。

图 3 GrGPPS与其他GPPS蛋白的系统发育分析Fig. 3 Phylogentic relationship of GrGPPS and some other GPPS proteins

利用DNAMAN将GrGPPS氨基酸序列与从NCBI中挑选的同源性较高的部分已知序列进行多序列比对分析，结果表明GrGPPS蛋白与已知蛋白序列在N端高度保守，且含有异戊烯基结构域（图 4），进一步表明其为类异戊烯基超家族成员。

图 4 GrGPPS与其他植物中GPPS氨基酸序列的多序列比对结果Fig. 4 Multiple sequence alignment of GrGPPS amino acid sequence with GPPS in other plants

通过使用ExPASy ProtParam tool进行分析，GrGPPS蛋白的相对分子质量为40 050，理论等电点为6.14，分子式为C₁₇₇₅H₂₈₄₈N₄₈₀O₅₃₃S₁₉。半衰期（mammalian reticulocytes，in vitro）为30 h。不稳定指数（instabilityindex）为34.85，脂肪族指数（aliphatic index）为95.22，总平均疏水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.035。蛋白质的疏水性通常依据蛋白的GRAVY值来预测，GRAVY值在2～-2，若为正值，则此蛋白为疏水性蛋白，反之则为亲水性蛋白。从ProtParam软件分析结果来看，GRAVY值为-0.708，说明GrGPPS为亲水性蛋白。GrGPPS蛋白含有20种氨基酸，其中丙氨酸（Ala）的量最高，为10.6%；其次是亮氨酸（Leu），为10.1%；色氨酸（Trp）量最低，为0.3%。

对GrGPPS进行稀有密码子分析（http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html），结果表明GrGPPS基因中稀有密码子占0.8%，无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可以选用BL21或Rosetta（DE3）进行原核表达。 3.2.3 蛋白质二级结构和三维建模

利用SSpro方法（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）对GrGPPS进行二级结构分析。结果表明该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占64.4%，β-折叠（E）占2.45%，无规则卷曲（C）占33.15%。

利用CPHmodels 3.2 Server在线软件（http://www.-cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）预测GrGPPS蛋白的三维结构（图 5），从图中可以看到GrGPPS的三维结构主要由螺旋结构和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致；另外，其三维结构形成“穴型”功能区域，暗示其在催化反应中起关键作用。

图 5 GrGPPS的三维结构预测 Fig. 5 Predicted three dimensional structure of GrGPPS protein

采用InterProScan在线工具预测GrGPPS蛋白的保守结构域，GrGPPS具有7个保守结构域（图 6），主要是聚丙烯合成酶（polyprenyl synthetase）（IPR000092），分别位于105～354位（PF00348）、286～298位（PS00444）和153～169位（PS00723）；萜类合成酶（terpenoid synthase）（IPR008949），分别位于75～366位（1.10.600.10）和77～363位（SSF48576）；聚丙烯相关合成酶（polyprenyl synthetase-related）（IPR017446），位于61～365位（PTHR12001）。另外，还有牻牛儿基焦磷酸合成酶结构域，在IPR中没有明确分类，位于61～365位（PTHR12001:SF8）。

图 6 InterProScan预测的GrGPPS蛋白保守结构域Fig. 6 Conserved domains of GrGPPS protein predicted by InterProScan

利用推测的蛋白序列检索NCBI的CDD（Conserved Domain Database）数据库，发现GrGPPS蛋白属于类异戊二烯超家族成员（图 7），其功能可能与单萜类物质的合成有关。

图 7 GrGPPS蛋白保守域分析Fig. 7 Conserved domain prediction of GrGPPS protein

利用ExPASy SignalP 4.0 Server（http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/）分析GrGPPS蛋白，并没有发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。

利用Expasy中的TMHMM工具（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测GrGPPS蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrGPPS蛋白非膜蛋白，无跨膜螺旋区。

利用在线工具WOLF PSORT（http://www.wolf-psort.org/）预测GrGPPS的亚细胞定位情况，结果显示该蛋白可能定位于叶绿体，定位系数为14.0（chlo: 14.0）。

使用ProtFun软件基于已知的具有相似功能蛋白的搜索和比对，对GrGPPS蛋白进行功能预测，结果显示GrGPPS蛋白嘌呤碱和嘧啶碱、翻译、能量代谢的功能的可能性为0.521、0.243、0.293，其可能性的数值远高于其他功能，这些数据都为后续的研究提供了一定的依据。 3.2.6 GrGPPS原核表达载体构建

使用SalI和 XhoI双酶切重组质粒pGEX-4T-1-GrGPPS，可切出约1 107 bp的片段（图 8），表明扩增的GrGPPS片段已插入载体pGEX-4T-1中。在此基础上，对重组表达质粒pGEX-4T-1-GrGPPS进行测序。结果表明，连入表达载体中的基因片段与目的序列一致，并且酶切位点连接处序列也都正确，未出现碱基突变及移码现象。表明已获得了正确的GrGPPS的原核表达重组质粒。

图 8 pGEX-4T-1-GrGPPS酶切检测 Fig. 8 Digestive detection of pGEX-4T-1-GrGPPS plasmidM-Marker 1-pGEX-4T-1-GrGPPS双酶切结果 M-Marker 1-digestion result of recombinant plasmid pGEX-4T-1-GrGPPS by SalI and XhoI

将重组质粒pGEX-4T-1- GrGPPS转化大肠杆菌Rosetta后进行诱导表达。在终浓度为1 mmol/L IPTG、37 ℃下分别诱导表达0、1、2、4、6和8 h后，提取大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明，插入有外源片段的重组质粒pGEX-4T-1-GrGPPS经IPTG诱导后，在预期的蛋白相对分子质量66 050（包括载体上GST蛋白）左右有1条蛋白条带，而未诱导时的转化重组质粒和pGEX-4T-1对照质粒均未出现这条蛋白带，表明重组质粒pGEX-4T-1-GrGPPS在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导表达了GrGPPS蛋白。当温度为37 ℃、诱导时间为4 h时，蛋白表达量已接近最大，8 h时最大（图 9）。

图 9 37 ℃不同时间诱导对重组蛋白表达量的影响 Fig. 9 Effect of different time on expression of recombinant protein at 37 ℃M-Marker 1～2-对照：37 ℃，IPTG终浓度为1 mmol/L时pGEX-4T-1空载体转化子诱导0和8 h的总蛋白；3～8-相同条件下，融合表达工程菌诱导0、1、2、4、6、8 h的总蛋白 M-Marker; 1—2-CK is the expressed product of pGEX-4T-1 with 1 mmol/L of IPTG induction for 0 and 8 h at 37 ℃; 3—8-The expressed product of pGEX-4T-1-GrGPPS with 1 mmol/L of IPTG induction for 0,1,2,4,6 and 8 h separately at 37℃.

到目前为止，GPPS的活性仅在少数植物中被研究，且GPPS蛋白主要存在于产生大量单萜的组织中，纯化非常困难^[28]，对GPPS的研究主要集中在其对单萜和倍半萜的影响，如Martin等^[29]对葡萄Vitis vinifera中VvGPPS的转录进行分析，表明VvGPPS基因在单萜生物合成中起重要作用；Chang等^[30]研究发现辣薄荷中的MpGPPS包含2个具有催化功能的大亚基和2个非催化的具有调控功能的小亚基，并且证实与薄荷醇的生物合成有关；Rai等^[15]从长春花中克隆到CrGPPS基因，发现CrGPPS在长春花中以杂聚肽和同聚肽2种形式存在，且发现只有含有GrGP PS.SSU的杂聚肽GPPS能调控MIA生物合成中的GPP流。然而Van Schie等^[20]研究发现由于病毒诱导基因沉默引起的番茄中LeGPPS表达量降低导致植株的严重矮小，进一步研究发现这些矮小植株中赤霉素的量降低，而类胡萝卜素和叶绿素的含量未发生变化，表明GPPS不仅在萜类的生物合成中起作用，而且与赤霉素的生物合成有关。

尽管GPPS在单萜生物合成中起着重要作用，但GPPS在植物中的功能以及在GPP代谢流中的调控机制研究的还很少。克隆基因的方法有cDNA差异显示法^[31]、设计简并引物同源克隆法^[32,33]以及分析EST数据库，根据基因预测设计特异引物，直接从cDNA文库或基因组文库中扩增基因为策略的一些方法，例如RACE、Tail-PCR等。本研究根据滇龙胆转录组GrGPPS基因序列，设计一对特异性引物，应用RT-PCR技术进行扩增，得到完整的cDNA序列，并命名为GrGPPS。经序列分析，发现GrGPPS全长1 107 bp，编码369个氨基酸。BLASTp分析结果显示，GrGPPS的同源蛋白较少，但与其他物种GPPS蛋白的相似性较高。以上这些结果表明GrGPPS基因属于类异戊二烯家族成员。原核表达载体pGEX-4T-1带有谷胱甘肽转移酶GST标签，由于GST标签蛋白较大，相对分子质量约2 600，在实验中常需要用凝血酶等将标签蛋白酶切后再进行目的蛋白的后续研究。

本研究成功构建了滇龙胆GrGPPS基因原核表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS，转入E. coli Rosetta（DE3），并成功诱导表达出GrGPPS蛋白。SDS-

PAGE结果表明龙胆叶片中的GrGPPS基因编码蛋白为单条带（图 9），因此GrGPPS蛋白可能为单亚基酶或二亚基同聚体，这需要进一步的实验验证。原核生物具有繁殖快、周期长等特点，为下一步纯化GrGPPS蛋白以及进行生物功能分析奠定基础。以体外实验模拟体内环境来生产生物体内化学成分是目前的科研热点，采用生物技术来缓解资源短缺等问题也是中医药现代化的目的之一。该研究有助于深入了解龙胆苦苷生物合成途径的分子基础，也为单萜类化合物的生物工程提供候选基因。