野百合为蝶形花科（Papilionaceae）猪屎豆属Crotalaria Linn. 植物野百合Crotalaria sessiliflora L. 的干燥全草，别名农吉利、鼠蛋草、响铃草、芝麻响铃铃、细叶芝麻铃等，其味淡，性平，功能为清热、利湿、解毒^[1]。在我国广泛用于多种疾病的治疗，主治痢疾、疮疖、耳鸣耳聋、头晕目眩及各种癌症如皮肤鳞状上皮癌、食管癌、宫颈癌等^[2]。野百合碱（monocrotaline）是野百合主要的活性成分。胰腺癌恶性程度高、预后差，且发病率近年来有上升趋势。目前，胰腺癌的早期诊断比较困难，确诊时多已是进展期，手术切除率低，化疗、放疗后仍易复发和转移，胰腺癌患者的平均生存期为6个月，位居癌症死亡的第5位^[3]。BxPC-3细胞系来源于低分化胰腺导管腺癌患者，其倍增时间为54 h，染色体数目为59条（2N），具有转移潜能。本研究选择人胰腺癌细胞株BxPC-3作为研究对象，探讨野百合碱对胰腺癌的抗肿瘤作用及相关机制。

野百合碱（monocrotaline，MCT，质量分数≥98%）购于美国Sigma公司，用二甲基亚砜（DMSO）配成储存液，-20 ℃保存，实验时用RPMI 1640培养液稀释，DMSO的体积分数小于0.1%。噻唑蓝（MTT）、碘化丙锭（PI）购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；DMEM培养液为美国Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物公司产品；培养液RPMI 1640购自Gibco公司；鼠抗人Cyclin B1单克隆抗体、ECL化学发光试剂盒购自美国Santa cruz公司；羊抗鼠HRP-IgG为Sigma公司产品。

FACS calibur流式细胞仪（美国Becton- Dickinson公司）、Thermo细胞培养箱（美国Thermo公司）、Olympus倒置相差显微镜（日本）、Thermo Varioskan Flash型多功能酶标仪（美国Thermo公司）。

人胰腺癌细胞株BxPC-3由德克萨斯理工大学王明海教授惠赠。

BxPC-3细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37 ℃、5% CO₂和一定湿度的培养箱中孵育，培养液中含青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/mL，细胞生长达汇合状态时，0.25%胰蛋白酶消化后传代。全部实验均采用对数生长期细胞，重复3次实验。

实验分为对照组（RPMI 1640）和不同质量浓度（5、10、20 μg/mL）野百合碱组。MTT比色法^[4]分别测定野百合碱作用24、48、72 h 后BxPC-3细胞的吸光度（A₅₇₀）值，计算细胞增殖率（增殖率＝实验组A₅₇₀值/对照组A₅₇₀值），每组均重复3次。

细胞按“2.2”项加样品培养72 h后终止培养，取出盖玻片，0.01 mol/L PBS洗5 min，置于分析纯甲醇中固定10 min后取出，挥干甲醇。将吉姆萨（Giemsa）染液与pH 7.2的索伦森氏（Sorensen）磷酸缓冲液以1∶9混合成工作液，加于盖玻片上染色10～20 min（镜下观察染色程度），待细胞充分显色后流水冲洗盖玻片，立即进行拍照和图像分析。

5、10 μg/mL野百合碱分别处理BxPC-3细胞72 h后，收集漂浮及贴壁细胞，70%冰乙醇固定后，置于-20 ℃储存备用。以单纯加入0.1% DMSO处理作为对照组。取出备用的收集细胞，用PBS洗涤及离心后，加入1 mg/mL RNase A和50 μg/mL PI，反应并染色30 min，流式细胞仪分析细胞倍性。

取生长状态良好的细胞，接种于96孔细胞培养板内，细胞随机分为对照组和野百合碱（5、10、20 μg/mL）组，每组设3个重复，培养72 h后进行染色体分析。按常规方法制备染色体标本，于收集细胞前2 h加入秋水仙素（终质量浓度为0.05 mg/mL），常规方法收集细胞，加入0.075 mol/L KCl溶液低渗作用30 min，离心取沉淀细胞，再用甲醇-冰醋酸（3∶1）混合液固定2～3次，每次20 min。取4 ℃洁净载玻片滴片制备染色体标本，用Giemsa染色后于光镜下进行核型及染色体数量分析。

分组、给药与细胞培养时间同“2.4”项，每组设5个复孔。各组收集BXPC-3细胞1×10⁶个，离心，弃上清，用冷PBS洗涤2次，按照Annexin V- FITC/PI染色试剂盒说明操作，分别加入缓冲液185 μL、Annexin V 10 μL、PI 5 μL，混匀，避光20 min，离心后弃去上清液，再加入冷PBS洗涤1次，用PBS 400 μL悬浮细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

取生长状态良好的细胞，接种于60 mm细胞培养皿内，细胞随机分为对照组和野百合碱（5、10、20 μg/mL）组，每组设3个重复，培养72 h后进行蛋白表达分析。采用1% NP40冰上裂解细胞球30 min，4 ℃条件下6 500×g离心30 min提取细胞总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。取各组细胞总蛋白20 μg上样，进行8% SDS-PAGE分离蛋白，电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入一抗Cyclin B1、β-actin（1∶1 000），室温反应2 h，TBST洗涤后加入相应二抗再反应1 h，膜经TBST洗涤后与电化学发光检测试剂反应，X光胶片压片曝光，显示结果。

数据以x±s表示，应用SPSS 16.0统计软件进行方差分析。

5、10、20 μg/mL野百合碱对BxPC-3细胞的增殖有明显的抑制作用，且抑制作用呈剂量和时间依赖性，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 野百合碱对BxPC-3增殖的抑制作用 (x±s,n=3) Table 1 Inhibition of MCT on proliferation of BxPC-3 cells (x±s,n=3) 组别 ρ / (μg∙mL-1) 增殖率 / % 24 h 48 h 72 h 对照 — 100.0 100.0 100.0 野百合碱 5 77.2±3.3 64.4±4.8 41.5±4.3 10 70.5±7.1** 52.1±5.4** 27.2±6.4** 20 64.8±7.8** 42.9±4.6** 18.6±5.2** 与对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01 P < 0.05 **P < 0.01 vs control group

表 1 野百合碱对BxPC-3增殖的抑制作用 (x±s,n=3) Table 1 Inhibition of MCT on proliferation of BxPC-3 cells (x±s,n=3)

与对照组比较，5 μg/mL野百合碱处理72 h后出现了巨型多核细胞，体积是对照组细胞的10～20倍，且20 μg/mL野百合碱处理后，90%的细胞成巨型多核细胞，见图 1。

图 1 二倍体和多倍体BxPC-3细胞 Fig.1 BxPC-3 cells of diploid and polyploid

野百合碱诱导BxPC-3细胞的结果发现，随着野百合碱质量浓度的增加，多倍体细胞（4N、8N）逐渐增加，存在剂量依赖关系（P＜0.05），见图 2。

图 2 流式细胞仪检测野百合碱诱导的BxPC-3细胞DNA量 Fig.2 DNA content in MCT-induced BxPC-3 cells analyzed by flow cytometry

根据美国ATCC的数据显示，BxPC-3细胞系的染色体数目为59条（2N）。染色体分析结果表明，野百合碱诱导BxPC-3细胞出现4N（染色体数目118±4）和8N（染色体数目236±6），进一步验证了上述数据的可靠性，见图 3。

图 3 染色体展示检测BxPC-3的染色体数目 Fig.3 Chromosome number of BxPC-3 cells

Annexin V-FITC/PI双标法检测结果显示，不同质量浓度的野百合碱均可诱导BxPC-3细胞凋亡，凋亡率随野百合碱质量浓度的增加而增大，与对照组比较差异显著（P＜0.05），且野百合碱不同质量浓度组间BxPC-3细胞凋亡率比较也有显著差异（P＜0.05）。结果见图 4。

图 4 经野百合碱处理后BxPC-3细胞的凋亡情况 Fig.4 Induced apoptosis of BxPC-3 by MCT treatment

与对照组比较，不同质量浓度的野百合碱作用于BxPC-3细胞72 h后BxPC-3细胞Cyclin B1的蛋白表达水平下降，差异显著（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见图 5。

图 5 野百合碱抑制BxPC-3细胞Cyclin B1蛋白的表达 Fig.5 Inhibition of MCT on protein expression of Cyclin B1 in BxPC-3 cells

野百合碱是从中药野百合中分离得到的单体化合物。体外和动物实验表明，野百合碱能够抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖与生长，其作用机制涉及直接杀伤肿瘤细胞、抑制核酸代谢、抑制肿瘤血管生成、诱导细胞凋亡、促进细胞分化等诸多方面^[2]，目前对于野百合碱抗肿瘤的作用机制还缺乏深入研究。本研究探索野百合碱对胰腺癌细胞的增殖抑制作用及其分子机制，以期为寻找新抗癌药物提供有价值的信息。

在基因毒性化合物、放射线、应激等DNA损伤情况下，肿瘤细胞往往形成多倍体单核巨细胞和多核巨细胞，这些巨细胞大部分趋于死亡或凋亡，促进多倍体细胞形成是控制某些恶性肿瘤进展的一种途径，但目前对肿瘤巨细胞形成和演变仍存在很大争议^[5]。本研究表明，应用野百合碱诱导BxPC-3细胞多倍体化，在5～20 μg/mL随着野百合碱质量浓度的增加和作用时间的延长，多倍体化细胞逐渐增加，并且存在着明显的时间和剂量依赖关系。野百合碱诱导的多倍体BxPC-3细胞含有多个细胞核，而不是分叶核，说明其已发生了核分裂。实验通过细胞形态学和流式细胞术分析，野百合碱诱导BxPC-3细胞的体积增大，2N和4N细胞逐渐减少，8N细胞逐渐增多，也进一步证明了野百合碱诱导BxPC-3细胞巨型多倍体化。野百合碱处理BxPC-3细胞后，细胞核分裂，而胞质不分裂，提示细胞停滞在细胞周期的G₂/M期。

细胞周期的调控在肿瘤的发生和治疗中有重要作用^[6]。Cyclin B是作用于G₂/M期的重要周期蛋白，可以促进G₂/M期转换而加速细胞周期进程。随着正常细胞周期和肿瘤细胞周期的深入研究，可以认为Cyclin B的异常表达与多种肿瘤的发生、发展相关，是一个极好的肿瘤标志物，对肿瘤的恶性生物学行为，及肿瘤的预后有意义^[7]。Cyclin B1在G₂期表达增加，Cyclin B1与p34cdc2形成激酶复合物，控制细胞由G₂进入M期。本研究结果显示，野百合碱作用72 h后，BxPC-3细胞Cyclin B1蛋白表达下降，提示野百合碱可能通过降低Cyclin B1蛋白表达将细胞阻滞在G₂/M期，抑制细胞增殖。

野百合碱通过抑制周期蛋白Cyclin B1的表达，导致多倍体巨细胞增加，出现4N、8N巨型BxPC-3多倍体细胞，促使BxPC-3细胞凋亡或死亡，然而其具体的作用机制还有待于进一步研究。