植物凝集素是一类具有高度特异性糖结合活性的蛋白，含有一个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域^[1]。van Damme等^[2]根据进化和结构相关性，将其分成7个家族，分别为豆科凝集素、雪花莲相关凝集素、含Hevein结构域的壳多糖结合蛋白、II型核糖体失活蛋白（RIP）、葫芦科韧皮部凝集素、木菠罗素（jacalin）家族和苋科凝集素。目前，已经发现的植物凝集素超过1 000种，广泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科、天南星科和石蒜科等众多植物类群中。

半夏Pinellia terenata (Thunb.) Breit. 为天南星科半夏属多年生草本植物，是中国的传统中药，以块茎入药，具有消痞散结、燥湿化痰、降逆止呕的功效^[3]。半夏主要含有生物碱、谷甾酸、多糖、氨基酸、挥发油、半夏蛋白及无机元素等多种有效成分，而凝集素是半夏蛋白的重要组分之一。半夏凝集素（Pinellia ternate agglutinin，PTA）隶属于雪花莲相关凝集素家族，该家族成员可专一性结合对甘露糖，具有抗虫、抗菌和凝血活性等药理作用^[4]。

自Yao等^[5]于2003年首次克隆了PTA基因以来，半夏凝集素序列被大量报道，就已报道的PTA序列而言，该序列无内含子。目前，PTA基因已相继成功转化了水稻、小麦、烟草、油菜、大青、菘蓝等，抗虫鉴定表明，相应的转基因植株对刺吸式害虫如褐飞虱、二化螟、麦蚜、桃蚜等均表现出一定抗性，但对其亚细胞定位的研究尚未见报道^{[6,7,8,9,10,11]}。本实验以半夏新鲜叶片的DNA为模板，NCBI库中已报道的PTA基因的序列设计特异性引物，克隆了PTA基因的全长，并将其连接到含有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pI1300-CaMV35S上，通过对基因序列的分析与其亚细胞定位的初步研究，旨在从分子水平阐明PTA抗病害的机制，以期为PTA基因的抗病虫害机制研究提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为来自川半夏主产区四川省南充市的野生半夏，经西华师范大学彭正松教授鉴定为半夏Pinellia ternata (Thunb.) Breit.。农杆菌GV3101、植物表达载体pI1300-CaMV35S-GFP和烟草Nicotiana tabacum L. 均由四川农业大学水稻研究所植物病理实验室提供。 1.2 方法 1.2.1 半夏DNA的提取及PTA基因的扩增

用常规的CTAB法提取半夏叶片的DNA，以其为模板用特异性引物PTA_F：5’-ACAGGTACCATGGCCTCCAAGCTCCTC-3’和PTA_R：5’ACAGGTACCAT-TCACCTTCTCCGTCACCA-3’（划线部分为kpnI酶切位点的序列）进行PCR扩增。PCR反应程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸1 min，共30个循环，72 ℃延伸10 min。 1.2.2 PTA基因对植物表达载体的转化

将PCR产物回收，连接于pEASY-Blunt Simple载体，鉴别阳性克隆pEASY-Blunt-PTA，经酶切和测序验证正确后，从pEASY-Blunt载体上酶切、回收PTA基因，将其连接于已切好的植物表达载体pI1300-CaMV35S-GFP，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后鉴定阳性克隆并抽提质粒。将质粒通过冻融转化法导入农杆菌GV3101感受态细胞中，鉴定农杆菌阳性克隆，备用。 1.2.3 序列分析

所获得的序列已提交至GenBank，PTA基因的序列号和蛋白质序号为KF154979和AGV40777。引物设计使用NTI软件完成；使用http//expasy.org/进行PTA基因的氨基酸序列翻译、相对分子量与等电点的预测；使用SignalP和Wolf程序分别对其信号肽切割位点和亚细胞定位进行预测；使用http//smart.embl-heidelbe-rg.de/对其结合域进行预测；使用DNAMAN6.0软件对相应的氨基酸序列进行比对，并用MEGA软件对其进行聚类分析。 1.2.4 PTA基因在烟草中的瞬时表达

将鉴定的农杆菌单克隆接种到5 mL含Kan和Rif的YEB液体培养基，于28 ℃培养16 h至吸光度（A₆₀₀）值为0.5。将菌液4 000 g/min离心10 min，用5 mL缓冲液10 mmol/L氯化镁重悬，用1 mL无菌医用注射器吸取菌液，注射器尖端贴紧烟草叶片，将菌液从下表皮缓缓注射进叶片中，48 h后将注射的叶片从烟草植株上取下，在荧光共聚焦显微镜下观察PTA基因的亚细胞定位。注射实验重复3～5次。 2 结果与分析 2.1 PTA的扩增及鉴定

以半夏叶片基因组DNA 为模板，用特异引物PTA_F、PTA_R进行扩增，其PCR产物为单一明亮的特异性片段，其大小约为850 bp，与预期片段大小相符（图 1）。将PCR扩增片段纯化回收后，克隆到pEASY-blunt载体，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子并酶切、回收PTA基因，将回收后的PTA基因连接到预先酶切好的植物载体pI1300-CaMV35S-GFP上，提取阳性重组质粒用kpnI单酶切，结果表明，酶切片段的大小约为850 bp，与原PCR产物的长度一致（图 2）。将重组质粒导入农杆菌GV3101，用PTA_F和GFP_R进行菌落PCR检测，结果表明，所选择的阳性克隆在约1 000 bp处均具有明显的条带（图 3）。说明插入的PTA基因的位置、方向及阅读框均正确，重组表达载体pI1300- CaMV35S-PTA-GFP构建成功。

图 1 PTA的PCR扩增Fig.1 PCR application of PTA

图 2 重组质粒pI1300-CaMV35S-PTA-GFP的单酶切结果Fig. 2 Single digestion of recombinant plasmid pI1300-CaMV35S-PTA-GFP

图 3 菌落PCR扩增 Fig. 3 PCR amplification of colonyM-Marker 3,5～7,11～12-阳性克隆的检测 1,2,4,8～10-未检出 M-Marker 3,5—7,11—12-detection of positive colony 1,2,4,8—10-not dectected

对PTA基因进行测序和分析，发现目的片段的长度为810 bp，其编码氨基酸残基的长度为269 bp。序列的N端含有一条24氨基酸的信号肽序列，其剪切位点位于第24位的丙氨酸（A₂₄）与第25位的缬氨酸（V₂₅）之间。PTA氨基酸序列中还含有3个保守的甘露糖位点结合位点基序，分别为位于第51～59位氨基酸的QXDCNAVLY，第172～180位氨基酸的QGDCNLVLY，和第234～242位氨基酸的QXXGXXVXY。进一步分析发现，第2个甘露糖结合位点基序最为保守，第3个甘露糖结合位点基序的特异性最强（4/9）。此外，该序列中还包含2个保守的B-lectin结合域，分别位于第27～131位氨基酸和第145～252位氨基酸（表 1和图 4）。

表 1(Table 1)

表 1 半夏属凝集素活性位点氨基酸序列分析 Table 1 Analysis on amino acid sequence of mannose binding sites from P 材料 序列号 甘露糖结合位点1 甘露糖结合位点2 甘露糖结合位点3 滴水珠 ABK88277 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDDGFAVVY 掌叶半夏 AAR27793 QDDCNAVLY QGDCNLVLY QEDGLAVIY 掌叶半夏 ADK56179 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QEDGFAVIY 半夏 AAR27794 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY 半夏 AAP20876 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY 半夏 ABX47148 QDDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY 半夏 AGV40777 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY

表 1 半夏属凝集素活性位点氨基酸序列分析 Table 1 Analysis on amino acid sequence of mannose binding sites from P

图 4 半夏属凝集素的氨基酸序列比对Fig. 4 Multiple alignments of amino acid sequence from PTA红色下划线为甘露糖结合位点，绿色下划线为信号肽序列 Three mannose binding sites and signal peptide were underlined by red and green

利用DNAMAN 软件对克隆所得的PTA（AGV40777）在GenBank数据库中查询得到半夏属属3个种6条凝集素基因氨基酸序列的登录信息进行同源比较（表 2）。其中，PTA基因（Pinellia ternata agglutinin，PTA，AAR27794、AAP20876和ABX47148）3条，掌叶PTA基因（Pinellia pedtaisecta agglutinin，PPA，AAR27793和ADK56179）2条，滴水珠凝集素基因（Pin ellia cordata agglutinin，PCA，ABK88277）1条。结果显示，半夏属凝集素的种间序列长度差异较大，其中，PTA的氨基酸序列长度为268～269 bp，而PPA和PCA的序列长度均为256～258 bp。相较于PPA（序列同源性为85.9%）而言，PTA序列间的差异小，同源性高达97.4%～100%。进一步分析发现，PTA AGV40777和AAR27794间的序列同源性最高（100%），PTA（AAP20876和ABX47148）均与PCA（ABK88277）序列同源性最低（82%）。以雪花莲凝集素基因的氨基酸序列为外类群（Galanthus nivalis agglutinin，GNA，AAL07474和AAL07476），采用MEGA软件的Neighbor-joining (NJ)方法对序列进行聚类，聚类结果（图 5）表明，PTA和PPA AAR27793聚为第I类，PPA ADK56179和PCA聚为第II类，而外类群的雪花莲凝集素单独聚为III类。

表 2(Table 2)

表 2 半夏属凝集素的氨基酸序列的同源性分析 Table 2 Homological analysis of amino acid sequences in PTA 凝集素 相似度 / % ABK88277 AAR27793 ADK56179 AAR27794 AAP20876 ABX47148 AGV40777 ABK88277 100 AAR27793 83.60 100 ADK56179 90.60 85.90 100 AAR27794 83.20 91.00 85.20 100 AAP20876 82.00 90.20 84.00 97.40 100 ABX47148 82.00 90.60 84.30 97.80 95.50 100 AGV40777 83.20 91.00 85.20 100 97.40 97.80 100

表 2 半夏属凝集素的氨基酸序列的同源性分析 Table 2 Homological analysis of amino acid sequences in PTA

图 5 基于NJ方法构建半夏属凝集素家族的系统进化树Fig. 5 Phylogenetic tree from PTA constructed by using NJ method

应用Wolf程序对PTA基因的亚细胞定位进行预测，分析表明PTA蛋白位于细胞膜上。为了进一步验证PTA的亚细胞定位，本实验构建了PTA 融合蛋白植物表达载体pI1300-CaMV35S- PTA-GFP并将该载体导入GV3101农杆菌菌株，通过注射器将其到烟草叶片中，共培养48 h后用FM4-64进行细胞膜染色，在激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，重组质粒pI1300-CaMV35S-PTA-GFP的绿色荧光基本均匀分布于整个细胞膜上（图 6），且GFP 绿色荧光区域同FM4-64的红色荧光区域完全重叠（图 6），表明PTA定位于细胞膜上，这与预测结果一致。

图 6 PTA在烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位Fig. 6 Subcellular location of PTA in epidermal cells of tobacco leaves重组质粒pI1300-CaMV35S-PTA-GFP FM4-64 融合图像

Yao等^[5,6]应用RACE技术克隆了PTA的cDNA全长并研究了相应的转基因烟草植物的抗虫性，结果表明，PTA的cDNA全长为810 bp，编码一条269个氨基酸的前体蛋白，蛋白质相对分子质量为29 400，转PTA的烟草显著地抑制了桃蚜Myzus persicae Sulzer的生长。张红宇等^[7]将PTA导入水稻并研究了转基因植株对褐飞虱的抗性，结果表明，克隆的PTA的蛋白质相对分子质量为29 100，编码一条268个氨基酸的前体蛋白，且转基因纯系对褐飞虱的存活率和发育进度均有显著的抑制作用。

Xiao等^[11]克隆了PTA并连同苏云金芽孢杆菌Cry1Ac基因同时导入大青，结果发现，PPT全长804 bp，蛋白质相对分子质量为25 000，转基因大青对小菜蛾Plutella xylostella L.和桃蚜的抗性增强。本实验克隆的PTA基因全长为810 bp，无内含子，编码一条具有269个氨基酸的前体蛋白。此外，该基因具有雪花莲相关的凝集素家族特有的特征信号序列和甘露糖结合位点基序，与 NCBI 中已经登录的PTA的氨基酸序列相似性高于97%，说明不同半夏植株的凝集素序列具有高度保守性。 3.2 同源性分析

高等植物的凝集素基因是一个多基因家族，van Damme等^[2]根据植物凝集素的进化及结构特点将其划分为7类。随着越来越多的新的植物凝集素被克隆，Jiang等^[12]根据其序列中结合域的特点进一步将植物凝集素划分为12类。本实验克隆所得的PTA与NCBI已报道的半夏属3种6条凝集素的多序列分析结果表明，半夏属植物的凝集素基因序列同源性很高。从半夏属凝集素甘露糖结合位点基序来看，半夏属凝集素的3个甘露糖结合位点基序的保守性不同，第1个甘露糖结合位点基序较为保守，仅第2个氨基酸存在差异；第2个结合位点的氨基酸序列完全一致；而第3个结合位点保守性最低且基序存在种属特异性，且同种的不同材料间也存在差异，进一步支持了张正英^[13]的结论。梁江丽等^[14]通过原核表达获得了PTA和PPA，比较分析发现，PPA的凝集活力为三叶半夏凝集素的4倍，从而推测凝集素第三个活性位点的氨基酸的差异可能是引起半夏和PPA凝集活性不同甚至药理作用不同的主要原因。本实验的发现，半夏属不同种凝集素的第3个甘露糖结合位点基序不尽相同，哪种凝集素的抗病虫功能最优，还需进一步验证。

从半夏属凝集素序列的聚类结果来看，所有的半夏凝集素序列聚为第I类，滴水珠凝集素序列聚为第II类，PPA在第I、II中均有分布，究其原因可能是PPA AAR22793是仅在块茎中特异表达，在不同的组织中分布着不同的同工凝集素^[15]。Liu等^[16]应用ISSR和SRAP分析了半夏属5个种的亲缘关系，研究表明，滴水珠与掌叶半夏的遗传关系较近，与半夏的遗传关系较远。本实验的聚类结果在一定程度上支持了Liu的结论，但凝集素序列是否可作为半夏属间分类标准，还值得进一步商榷。 3.3 亚细胞定位分析

Hwang等^[17]通过对胡椒凝集素（CaMBL1）基因的研究发现，CaMBL1基因的氨基酸序列中含有GNA-related lectin结合域，可特异识别番茄疮痂病辣椒斑点病菌Xanthomonas campestris pv vesicatoria表面的甘露糖，且该基因定位于质膜上。CaMBL1基因可通过调节胡椒叶表面的细胞死亡、水杨酸的积累和防御基因的表达量，从而起到抑菌作用。Chen等^[18]研究了水稻Pi-d2基因对水稻稻瘟病的抗性，结果发现，Pi-d2基因的氨基酸序列含有一个B-lectin结合域和一个丝氨酸-苏氨酸激酶结合域，且 Pi-d2基因定位于质膜上，过量表达Pi-d2基因可以增强转基因植株对稻瘟病菌Magnaporthe grisea strain ZB15的抗性。结合之前的报道，本实验进一步采用FM4-64为探针荧光标记细胞膜，初步将其定位于细胞膜上。