中麻黄Ephedra intermedia Schrenk ex Mey. 是麻黄科中麻黄属多年生小灌木植物，主产于甘肃、青海、陕西、新疆、河北、山东、内蒙等省区，以西北地区最为常见。生于海拔数百米至2 000多米的干旱地区，沙漠地区以及干旱的山坡或草地上，是被《中国药典》2010年收录的正品麻黄之一，也是甘肃省的主产药材之一^[1,2]。由于近年来滥采乱挖现象严重，致使中麻黄野生资源日渐枯竭，地面覆盖逐年减少，已成为濒危药用植物^[3]。因此，中麻黄资源的可持续性利用和保护工作势在必行。

近年来，DNA分子标记技术已在植物种质资源利用与保护方面得到广泛应用，并成为研究热点^[4,5,6,7]。简单重复序列区间（inter simple sequence repeat,ISSR）是由Zietkiewicz等于1994年发展的一种基于微卫星系列的新的分子标记技术，用于检测简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）间DNA序列差异，具有不需要知道序列信息、简便、快捷、重复性好等特点^[8]。因此，本研究利用ISSR分子标记技术对甘肃不同居群中麻黄品种进行遗传多样性分析，为中麻黄资源的合理开发、利用、保护和育种工作提供遗传学理论基础。

材料为甘肃省不同居群中麻黄地上草质茎，采集信息见表 1，采样时选取无病虫害的幼嫩地上茎，放入装有硅胶的塑封袋中迅速干燥，并带回实验室于-20 ℃冰柜中保存。全部样品由甘肃中医学院中药资源教研室晋玲教授鉴定为麻黄科（Ephedraceae）中麻黄Ephedra intermedia Schrenk ex Mey. 的原植物。

表 1(Table 1)

表 1 植物材料信息 Table 1 Information of plant materials 编号 居群代码 采集地 样本数 类型 1 rss 甘肃省兰州市榆中县 仁寿山 19 半野生 2 xls 甘肃省兰州市安宁区 兴隆山 18 野生 3 jp 甘肃省酒泉市文殊镇 20 野生 4 zy 甘肃省张掖市高台县 南华镇 9 野生 5 ym 甘肃省玉门市油区 20 野生 6 mq 甘肃省民勤沙生植物园 13 栽培 7 tglsm 腾格里沙漠 20 野生 8 glyht 甘肃省古浪县洋湖塘镇 18 栽培 9 glhhx 甘肃省古浪县黄花乡 10 栽培 10 glhzt-y 甘肃省武威市古浪县 海子滩镇 8 野生 11 glhzt-z 甘肃省武威市古浪县 海子滩镇 8 栽培

表 1 植物材料信息 Table 1 Information of plant materials

凝胶成像系统（美国Bio-Rad）；PCR扩增仪（德国Biometra）；台式高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司TGL16M型）；DYY—7型电泳仪（北京六一仪器厂）；电泳槽（北京六一仪器厂）。

ISSR随机引物（根据British Columbia大学公布的序列设计，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）；CTAB、EDTA、SDS、Tris、PVP、β-巯基乙醇（西安科昊生物工程有限责任公司）；RNaseA、Agarose琼脂糖、EB、TaqDNA聚合酶，dNTPs，10×缓冲液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；其他化学试剂均为国产分析纯。

采用改良CTAB法^[9]提取不同居群中麻黄样本基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，适当稀释后保存于-20 ℃冰箱中备用。

反应总体系为20 μL，内含10×PCR 缓冲液（Mg²⁺ Plus）2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L以及DNA模板30 ng。扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，根据不同引物的退火温度复性45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存结束反应。

用筛选出的12条ISSR引物^[10]按其最佳退火温度（表 2）逐条对11个不同居群样本基因组DNA进行PCR扩增。反应结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TBE，电压100 V下电泳90 min左右，EB（10 mg/mL）染色20 min，在凝胶成像系统下检测并拍照保存。

表 2(Table 2)

表 2 不同引物ISSR引物最佳退火温度 Table 2 Optimal annealing temperature for PCR reaction by different ISSR primers 引物编号 引物序列 (5’ to 3’) Tm值 / ℃ 退火温度 / ℃ UBC-811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 52.00 54.8 UBC-825 ACACACACACACACACT 50.00 50.4 UBC-826 ACACACACACACACACC 52.00 55.5 UBC-827 ACACACACACACACACG 52.00 57.7 UBC-834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 52.00～54.00 51.3 UBC-836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 52.00～54.00 55.5 UBC-842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 54.00～56.00 54.7 UBC-846 CACACACACACACACART 52.00～54.00 50.4 UBC-848 CACACACACACACACARG 54.00～56.00 54.8 UBC-866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC 60.00 59.3 UBC-885 BHBGAGAGAGAGAGAGA 48.00～54.00 54.7 UBC-895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 58.00 60.7 R = (A,G),Y = (C,T),B = (C,G,T),H = (A,C,T)

表 2 不同引物ISSR引物最佳退火温度 Table 2 Optimal annealing temperature for PCR reaction by different ISSR primers

采用人工读带法，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，建立数据矩阵。利用Popgen32软件对数据资料进行遗传多样性统计，分析各居群多态位点百分率（PPL）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon’s多态性信息指数（I）、居群总基因多样性（H_t）、居群内基因多样性（H_s）、基因分化系数（G_st），基因流（N_m）、Nei’s遗传一致度和遗传距离（D），并根据Nei’s遗传距离进行UPGMA聚类分析，应用NTSYS软件构建系统树状图。

用筛选出的12条ISSR引物对所有中麻黄基因组DNA进行扩增和电泳检测。结果显示，大部分样本均能扩增出清晰、数量多的条带，扩增产物碱基数在200～2 000 bp。引物UBC-866和UBC-895对甘肃省兰州市安宁区兴隆山中麻黄居群14个样本的扩增图谱见图 1。

图 1

Fig. 1

1～14-样品 M-Marker 1—14-samples M-Marker图 1 UBC-866 (A) 和UBC-895 (B) 对xls居群部分样本的扩增结果 Fig. 1 Amplification of samples from xls population by UBC-866 (A) and UBC895 (B)

12条引物对11个居群的163个个体进行了ISSR分析，共检测到位点175个，其中多态性位点150个，PPL值为85.71%，说明中麻黄具有较高的遗传多样性。根据Popgen软件统计结果（表 3），中麻黄居群间的H为0.211 4，I为0.332 1，而不同居群内的PPL在21.14%～62.29%，其中最高的是rss；最低的是glhzt-z。H为0.084 6～0.201 3，I为0.123 3～0.305 9，H和I的大小与各PPL的高低趋势基本一致，各项系数均是rss最高，glhzt-y的栽培居群最低。此外，由于居群间的PPL、H和I均高于各居群内的值，说明中麻黄的居群内的遗传多样性水平低于居群间。Wright提出当基因流N_m＞1时，居群间存在一定的基因流，其值越大基因交流越强^[11]，在中麻黄的11个居群中，N_m值为1.428 6，表明不同中麻黄居群间存在一定基因流，但水平不高。

表 3(Table 3)

表 3 11个不同居群中麻黄遗传信息参数 Table 3 Parameters of genetic information on 11 populations of E. intermedia 居群 样本个数 总位点数 多态性标记位点数 PPL / % H I rss 19 175 109 62.29 0.201 3 0.305 9 xls 18 175 104 59.43 0.168 7 0.261 9 glhzt-z 8 175 37 21.14 0.084 6 0.123 3 glhzt-y 8 175 51 29.14 0.101 4 0.151 6 zy 9 175 96 54.86 0.177 8 0.270 6 jp 20 175 108 61.71 0.191 8 0.294 0 ym 20 175 101 57.71 0.191 2 0.288 2 mq 13 175 89 50.86 0.175 3 0.261 9 glhhx 10 175 73 41.71 0.125 9 0.195 5 tglsm 20 175 102 58.29 0.167 8 0.260 8 glyht 18 175 100 57.14 0.141 1 0.225 8 总计 163 175 150 85.71 0.211 4 0.332 1

表 3 11个不同居群中麻黄遗传信息参数 Table 3 Parameters of genetic information on 11 populations of E. intermedia

通过Popgen软件分析得到中麻黄各居群的H_t为0.211 9，H_s为0.157 0，根据H_t和H_s来计算G_st为0.259 3。这表明有25.93%的变异存在于居群间，而74.07%的变异存在于居群内。居群的遗传分化表明，中麻黄居群间的分化程度较小，但居群内部却具有高度的遗传分化。

Popgen软件统计结果表明，11个不同居群中麻黄之间遗传距离的变异范围是0.014 4～0.159 8（表 4），其中mq与glhzt-z之间的遗传距离最大，为0.159 8，这也表明两者之间的亲缘关系最远。tglsm和古glyht之间的遗传距离最近，为0.014 4，说明二者之间亲缘关系最近。

表 4(Table 4)

表 4 中麻黄居群遗传距离和遗传一致度 Table 4 Genetic distance and genetic identity of E. intermedia populations 居群 rss xls jp zy ym mq tglsm glyht glhhx glhzt-y glhzt-z rss **** 0.985 5 0.973 2 0.965 7 0.959 7 0.935 1 0.957 2 0.949 5 0.936 1 0.900 1 0.878 1 xls 0.014 6 **** 0.984 2 0.952 9 0.957 6 0.945 7 0.959 9 0.946 4 0.932 5 0.898 0 0.864 2 jp 0.027 1 0.015 9 **** 0.972 6 0.966 7 0.958 1 0.962 3 0.949 5 0.939 6 0.898 5 0.870 7 zy 0.034 9 0.048 2 0.027 8 **** 0.984 8 0.950 7 0.969 7 0.963 6 0.955 7 0.905 8 0.885 9 ym 0.041 1 0.043 3 0.033 8 0.015 3 **** 0.967 3 0.977 0 0.961 1 0.959 4 0.897 7 0.888 8 mq 0.067 1 0.055 8 0.042 8 0.050 6 0.033 3 **** 0.960 9 0.928 5 0.923 3 0.864 7 0.852 3 tglsm 0.043 7 0.040 9 0.038 4 0.030 8 0.023 3 0.039 9 **** 0.985 7 0.974 4 0.901 9 0.885 9 glyht 0.051 8 0.055 1 0.051 9 0.037 1 0.039 6 0.074 2 0.014 4 **** 0.980 9 0.913 4 0.896 3 glhhx 0.066 0 0.069 8 0.062 3 0.045 3 0.041 5 0.079 8 0.025 9 0.019 3 **** 0.896 7 0.890 9 glhzt-y 0.105 2 0.107 6 0.107 1 0.099 0 0.107 9 0.145 3 0.103 3 0.090 6 0.109 0 **** 0.955 7 glhzt-z 0.130 0 0.145 9 0.138 4 0.121 1 0.117 9 0.159 8 0.121 1 0.109 4 0.115 5 0.045 3 **** Nei’s遗传一致度（对角线以上），遗传距离（对角线以下） Nei’s genetic identity (above diagonal),and genetic distance (below diagonal)

表 4 中麻黄居群遗传距离和遗传一致度 Table 4 Genetic distance and genetic identity of E. intermedia populations

为了进一步表明各居群间的亲缘关系，利用NTSYS软件构建各居群Nei’s遗传距离UPGMA聚类图，通过聚类图可直接反映甘肃11个中麻黄居群间的亲缘关系。结果表明，在遗传距离0.12处glhzt-z和glhzt-y，其他各居群归为另一类；在遗传距离0.055处，民勤沙生植物园栽培居群被单独聚为一类，其余各居群归为一类；在遗传距离0.045处，rss、xls和jp的居群聚为一类，其他各居群归为另一类；在遗传距离0.038处，zy和ym为一类，tglsm、glhhx和glhht聚为一类，亲缘关系与地理分布具有一定的相关性（图 2）。

图 2

Fig. 2

图 2 11个居群中麻黄的UPGMA聚类树 Fig. 2 UPGMAdendrogram for 11 populations of E. intermedia

遗传多样性一般指种内的遗传差异水平，它可以反映了一个物种适应环境的能力以及可被改造和利用的潜力^[12]，如果一个物种的遗传多样性水平降低，就会导致其适应能力变差，有害隐形基因表达增加，最终会导致该物种的退化，这对于稀有和濒危物种的生物多样性保护是十分不利的。本课题利用12条ISSR随机引物对甘肃11个不同居群的163个样本扩增后，多态位点率为85.71%，比裸子植物的平均多态位点比率70.9%^[13]高，说明中麻黄在物种水平上具有较高的遗传多样性。Popgen32软件统计结果表明居群内的H、I均比居群间的低，说明中麻黄的遗传多样性主要来自于居群间，因此在采取保护措施时应尽量保护数量多的居群。此外，由于不同中麻黄居群间基因流水平不高，导致居群内遗传多样性低，为了防止居群内中麻黄种质退化，应加强不同地区间中麻黄的基因交流。

根据基因分化系数估算的11个居群间的遗传分化系数为0.259 3，说明居群间的基因变异只占总的基因多样性的25.93%，居群内占74.07%。这表明大量的遗传分化主要存在于中麻黄居群内，少量的遗传分化存在于居群之间，这与其在不同地区间基因流有关，可以防止中麻黄居群内的近交衰退。此外，由于中麻黄主要分布在干旱的荒漠、戈壁地区，各居群生境类型简单，使其受生态环境影响差异不大，以至居群间的遗传分化程度较小。

许多研究表明，亲缘关系远近与地理分布呈一定相关性^[14,15]。从聚类结果来看，地理距离较近的古浪县洋湖塘镇居群和古浪黄花乡居群、古浪县海子滩镇野生居群和栽培居群、兰州仁寿山和兴隆山居群均被聚为一类，充分表明了具有相同遗传背景的中麻黄居群其地理距离越近，亲缘关系也越近，所以相距较远的地区中麻黄间的基因交流有阻碍性。但在聚为一支的酒泉市文殊镇居群和兰州兴隆山、仁寿山居群中，前者却与后者的地理距离较远，说明地理差异并不是决定亲缘关系远近的惟一因素，其还受到繁育系统、生境条件和基因流多方面的影响，中麻黄遗传多样性是由其基因多样性和环境因素共同决定的。