中草药  2014, Vol. 45 Issue (12): 1764-1768
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基于ISSR的甘肃中麻黄遗传多样性研究
朱田田1,3,4, 晋玲1,2,3 , 杜弢1,4, 崔治家1,3, 张弦飞1, 张延红1,4    
1. 甘肃中医学院, 甘肃 兰州 730000;
2. 甘肃省高校中(藏)药化学质量研究省级重点实验室, 甘肃 兰州 730000;
3. 甘肃中医学院中(藏)药资源研究所, 甘肃 兰州 730000;
4. 甘肃中医学院药用植物遗传育种研究所, 甘肃 兰州 730000
摘要目的 研究甘肃不同居群中麻黄Ephedra intermedia的遗传多样性。方法 应用ISSR分子标记技术对甘肃省11个居群的中麻黄样本进行分析,利用POPGENE 32软件分析Nei’s基因多样性指数(H)等遗传信息参数,应用NTSYS软件构建亲缘关系UPGMA聚类图。结果 12条引物共检测到175个位点,其中多态性位点150个,多态位点百分率(PPL)为85.71%。中麻黄居群间的H为0.211 4,Shannon’s多样性信息指数(I)为0.332 1,种群间基因分化系数(Gst)为0.259 3,基因流(Nm)为1.428 6,遗传距离0.014 4~0.159 8。结论 甘肃中麻黄种群遗传多样性水平较高,但居群内遗传多样性水平低于居群间;中麻黄种群的遗传变异主要存在于居群内;亲缘关系与地理分布具有一定的相关性。
关键词甘肃     中麻黄     ISSR     遗传多样性     分子标记技术    
Genetic diversity analysis on Ephedra intermedia from Gansu based on ISSR
ZHU Tian-tian1,3,4, JIN Ling1,2,3, DU Tao1,4, CUI Zhi-jia1,3, ZHANG Xian-fei1, ZHANG Yan-hong1,4    
1. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;
2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of College of Gansu Province, Lanzhou 730000, China;
3. Research Institute of Medicinal Plant Genetic Breeding, Lanzhou 730000, China;
4. Centre of Urban Ecology and Environmental Biotechnology, Lanzhou City University, Lanzhou 730000, China
Abstract: Objective To investigate the genetic diversity of Ephedra intermedia from different populations in Gansu. Methods ISSR markers were used to analyze the genetic diversity of 11 populations of E. intermedia. Nei's genetic diversity index (H) and other parameters of genetic information were calculated by POPGEN 32. UPGMA relationship dendrogram was clustered by NTSYS. Results Twelve primers produced 185 bands, among which 150 were polymorphic bands, and the percentage of polymorphic loci (PPL) was 85.71%. H and Shannon's information index (I) were 0.211 4 and 0.332 1, and genetic differentiation coefficient (Gst) and gene flow (Nm) were 0.259 3 and 1.428 6 within the population levels. The genetic distance varied from 0.014 4 to 0.159 8. Conclusion The genetic diversity among the populations of E. intermedia is at higher level, but the level of genetic diversity within populations than between populations. Genetic variance of E. intermedia mainly exists among populations. The genetic distance of E. intermedia is associated with geographical distance.
Key words: Gansu province     Ephedra intermedia Schrenk ex Mey.     ISSR     genetic diversity     molecular marker    

中麻黄Ephedra intermedia Schrenk ex Mey. 是麻黄科中麻黄属多年生小灌木植物,主产于甘肃、青海、陕西、新疆、河北、山东、内蒙等省区,以西北地区最为常见。生于海拔数百米至2 000多米的干旱地区,沙漠地区以及干旱的山坡或草地上,是被《中国药典》2010年收录的正品麻黄之一,也是甘肃省的主产药材之一[1,2]。由于近年来滥采乱挖现象严重,致使中麻黄野生资源日渐枯竭,地面覆盖逐年减少,已成为濒危药用植物[3]。因此,中麻黄资源的可持续性利用和保护工作势在必行。

近年来,DNA分子标记技术已在植物种质资源利用与保护方面得到广泛应用,并成为研究热点[4,5,6,7]。简单重复序列区间(inter simple sequence repeat,ISSR)是由Zietkiewicz等于1994年发展的一种基于微卫星系列的新的分子标记技术,用于检测简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)间DNA序列差异,具有不需要知道序列信息、简便、快捷、重复性好等特点[8]。因此,本研究利用ISSR分子标记技术对甘肃不同居群中麻黄品种进行遗传多样性分析,为中麻黄资源的合理开发、利用、保护和育种工作提供遗传学理论基础。

1 材料与仪器 1.1 材料

材料为甘肃省不同居群中麻黄地上草质茎,采集信息见表 1,采样时选取无病虫害的幼嫩地上茎,放入装有硅胶的塑封袋中迅速干燥,并带回实验室于-20 ℃冰柜中保存。全部样品由甘肃中医学院中药资源教研室晋玲教授鉴定为麻黄科(Ephedraceae)中麻黄Ephedra intermedia Schrenk ex Mey. 的原植物。

表 1 植物材料信息 Table 1 Information of plant materials
1.2 仪器与试剂

凝胶成像系统(美国Bio-Rad);PCR扩增仪(德国Biometra);台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司TGL16M型);DYY—7型电泳仪(北京六一仪器厂);电泳槽(北京六一仪器厂)。

ISSR随机引物(根据British Columbia大学公布的序列设计,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成);CTAB、EDTA、SDS、Tris、PVP、β-巯基乙醇(西安科昊生物工程有限责任公司);RNaseA、Agarose琼脂糖、EB、TaqDNA聚合酶,dNTPs,10×缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);其他化学试剂均为国产分析纯。

2 方法 2.1 基因组DNA提取及检测

采用改良CTAB法[9]提取不同居群中麻黄样本基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性,适当稀释后保存于-20 ℃冰箱中备用。

2.2 ISSR-PCR反应体系与扩增程序

反应总体系为20 μL,内含10×PCR 缓冲液(Mg2+ Plus)2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,引物0.4 μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L以及DNA模板30 ng。扩增程序:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,根据不同引物的退火温度复性45 s,72 ℃延伸2 min,40个循环,72 ℃延伸7 min,4 ℃保存结束反应。

2.3 供试样品电泳检测

用筛选出的12条ISSR引物[10]按其最佳退火温度(表 2)逐条对11个不同居群样本基因组DNA进行PCR扩增。反应结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳缓冲液为1×TBE,电压100 V下电泳90 min左右,EB(10 mg/mL)染色20 min,在凝胶成像系统下检测并拍照保存。

表 2 不同引物ISSR引物最佳退火温度 Table 2 Optimal annealing temperature for PCR reaction by different ISSR primers

2.4 数据统计与分析

采用人工读带法,在相同迁移率位置上,有带记为1,无带记为0,建立数据矩阵。利用Popgen32软件对数据资料进行遗传多样性统计,分析各居群多态位点百分率(PPL)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、居群总基因多样性(Ht)、居群内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst),基因流(Nm)、Nei’s遗传一致度和遗传距离(D),并根据Nei’s遗传距离进行UPGMA聚类分析,应用NTSYS软件构建系统树状图。

3 结果与分析 3.1 ISSR-PCR扩增结果

用筛选出的12条ISSR引物对所有中麻黄基因组DNA进行扩增和电泳检测。结果显示,大部分样本均能扩增出清晰、数量多的条带,扩增产物碱基数在200~2 000 bp。引物UBC-866和UBC-895对甘肃省兰州市安宁区兴隆山中麻黄居群14个样本的扩增图谱见图 1

1~14-样品 M-Marker
1—14-samples M-Marker
图 1 UBC-866 (A) 和UBC-895 (B) 对xls居群部分样本的扩增结果 Fig. 1 Amplification of samples from xls population by UBC-866 (A) and UBC895 (B)
3.2 中麻黄遗传多样性分析

12条引物对11个居群的163个个体进行了ISSR分析,共检测到位点175个,其中多态性位点150个,PPL值为85.71%,说明中麻黄具有较高的遗传多样性。根据Popgen软件统计结果(表 3),中麻黄居群间的H为0.211 4,I为0.332 1,而不同居群内的PPL在21.14%~62.29%,其中最高的是rss;最低的是glhzt-z。H为0.084 6~0.201 3,I为0.123 3~0.305 9,HI的大小与各PPL的高低趋势基本一致,各项系数均是rss最高,glhzt-y的栽培居群最低。此外,由于居群间的PPL、HI均高于各居群内的值,说明中麻黄的居群内的遗传多样性水平低于居群间。Wright提出当基因流Nm>1时,居群间存在一定的基因流,其值越大基因交流越强[11],在中麻黄的11个居群中,Nm值为1.428 6,表明不同中麻黄居群间存在一定基因流,但水平不高。

表 3 11个不同居群中麻黄遗传信息参数 Table 3 Parameters of genetic information on 11 populations of E. intermedia
3.3 中麻黄不同居群的遗传分化分析

通过Popgen软件分析得到中麻黄各居群的Ht为0.211 9,Hs为0.157 0,根据HtHs来计算Gst为0.259 3。这表明有25.93%的变异存在于居群间,而74.07%的变异存在于居群内。居群的遗传分化表明,中麻黄居群间的分化程度较小,但居群内部却具有高度的遗传分化。

3.4 中麻黄居群间遗传距离与聚类分析

Popgen软件统计结果表明,11个不同居群中麻黄之间遗传距离的变异范围是0.014 4~0.159 8(表 4),其中mq与glhzt-z之间的遗传距离最大,为0.159 8,这也表明两者之间的亲缘关系最远。tglsm和古glyht之间的遗传距离最近,为0.014 4,说明二者之间亲缘关系最近。

表 4 中麻黄居群遗传距离和遗传一致度 Table 4 Genetic distance and genetic identity of E. intermedia populations

为了进一步表明各居群间的亲缘关系,利用NTSYS软件构建各居群Nei’s遗传距离UPGMA聚类图,通过聚类图可直接反映甘肃11个中麻黄居群间的亲缘关系。结果表明,在遗传距离0.12处glhzt-z和glhzt-y,其他各居群归为另一类;在遗传距离0.055处,民勤沙生植物园栽培居群被单独聚为一类,其余各居群归为一类;在遗传距离0.045处,rss、xls和jp的居群聚为一类,其他各居群归为另一类;在遗传距离0.038处,zy和ym为一类,tglsm、glhhx和glhht聚为一类,亲缘关系与地理分布具有一定的相关性(图 2)。

图 2 11个居群中麻黄的UPGMA聚类树 Fig. 2 UPGMAdendrogram for 11 populations of E. intermedia
4 讨论

遗传多样性一般指种内的遗传差异水平,它可以反映了一个物种适应环境的能力以及可被改造和利用的潜力[12],如果一个物种的遗传多样性水平降低,就会导致其适应能力变差,有害隐形基因表达增加,最终会导致该物种的退化,这对于稀有和濒危物种的生物多样性保护是十分不利的。本课题利用12条ISSR随机引物对甘肃11个不同居群的163个样本扩增后,多态位点率为85.71%,比裸子植物的平均多态位点比率70.9%[13]高,说明中麻黄在物种水平上具有较高的遗传多样性。Popgen32软件统计结果表明居群内的HI均比居群间的低,说明中麻黄的遗传多样性主要来自于居群间,因此在采取保护措施时应尽量保护数量多的居群。此外,由于不同中麻黄居群间基因流水平不高,导致居群内遗传多样性低,为了防止居群内中麻黄种质退化,应加强不同地区间中麻黄的基因交流。

根据基因分化系数估算的11个居群间的遗传分化系数为0.259 3,说明居群间的基因变异只占总的基因多样性的25.93%,居群内占74.07%。这表明大量的遗传分化主要存在于中麻黄居群内,少量的遗传分化存在于居群之间,这与其在不同地区间基因流有关,可以防止中麻黄居群内的近交衰退。此外,由于中麻黄主要分布在干旱的荒漠、戈壁地区,各居群生境类型简单,使其受生态环境影响差异不大,以至居群间的遗传分化程度较小。

许多研究表明,亲缘关系远近与地理分布呈一定相关性[14,15]。从聚类结果来看,地理距离较近的古浪县洋湖塘镇居群和古浪黄花乡居群、古浪县海子滩镇野生居群和栽培居群、兰州仁寿山和兴隆山居群均被聚为一类,充分表明了具有相同遗传背景的中麻黄居群其地理距离越近,亲缘关系也越近,所以相距较远的地区中麻黄间的基因交流有阻碍性。但在聚为一支的酒泉市文殊镇居群和兰州兴隆山、仁寿山居群中,前者却与后者的地理距离较远,说明地理差异并不是决定亲缘关系远近的惟一因素,其还受到繁育系统、生境条件和基因流多方面的影响,中麻黄遗传多样性是由其基因多样性和环境因素共同决定的。

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