变形链球菌Streptococcus mutans是目前医学界公认的最主要的口腔致龋病菌^[1]，其致龋机制是通过直接黏附，然后在短时间内发酵口腔中碳水化合物的残渍而产生酸液迅速腐蚀牙表面，以及代谢过程中产生葡萄糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF）以合成水不溶性葡聚糖（water-insoluble glucans，WIG），促进病菌黏附到牙齿表面形成牙菌斑，阻止酸性物质扩散，在牙表面形成脱矿致龋^[2,3,4]。因此减少变形链球菌的产酸能力、黏附能力以及降低GTF活性和WIG合成能力，对于预防龋齿有重要意义。由于传统氟化物治疗方法中氟化物浓度的稳定性，长期使用后口腔菌株产生的耐氟性以及氟过量导致使用者慢性中毒等问题，使得氟化物的应用存在了诸多的局限性^[5,6]。近年来寻找安全有效的天然提取物来取代目前的氟化物是防治龋齿领域的一大研究热点，甜茶苷是甜叶悬钩子Rubus suarissimus S. Lee的特有功能成分，具有抗菌、抗炎、降血糖、调血脂、辅助治疗糖尿病等作用^[7]。

目前对于甜茶苷抑龋能力已有一些报道，但大部分都是针对其粗提物的功效研究，未见对其单体相关研究的报道。为进一步探讨其对于变形链球菌致龋能力的影响，本研究通过检测甜茶苷对于变形链球菌产酸能力、GTF产生和WIG合成能力的影响，来探讨甜茶苷抑制变形链球菌致龋的作用机制，为预防龋齿提供理论参考。

变形链球菌菌株（国际标准菌株ATCC 25175），由ATCC（美国）购得。甜茶苷（质量分数99%，由University of Kentucky提供）。李氏菌增菌肉汤（LB）固体和液体基础培养基、TSBYE液体培养基（EMD Millipore，Inc.）；硫酸铵、蒽酮、葡聚糖、磷酸盐缓冲溶液、考马斯亮蓝G250（Oxoid Ltd，英国）；小牛血清白蛋白（Remel，美国）。

恒温厌氧培养箱、紫外分光光度计（Fisher Scientific，美国）；高速温控离心机（Merck KGaA，德国）。

取出−80 ℃储存的变形链球菌ATCC 25175，用常规方法接种到4 mL TSBYE溶液中，并在37 ℃恒温箱厌氧环境下（80% N₂、15% CO₂、5% H₂）培养16 h，然后取出800 μL菌液加入4 mL新鲜TSBYE溶液内制成混悬液，备用。

取出备用菌液1 mL，分别加入盛有5 mL体积分数为5%甜茶苷、木糖醇的TSBYE溶液的试管中，并设置对照组（只加培养基）。以上实验组和对照组每组3支平行管，共计9支。将各组初始pH值调为7.04，在37 ℃恒温箱厌氧环境下（80% N₂、15% CO₂、5% H₂）培养48 h，室温下离心，取上清液，测量上清液的pH值，计算培养48 h内的pH值的变化。实验重复3次，结果取平均值，根据公式计算pH值变化量（∆pH）来评价药物对变形链球菌产酸能力的影响。

∆pH＝初始pH值（7.04）－终止pH值

将备用的菌液分别取0.5 mL接种至盛有5 mL LB液体培养基的试管中，对照组只加培养基，给药组分别加入甜茶苷或木糖醇，使其终质量浓度为20、50、200、500 μg/mL，每组3支试管。在每支试管中插入一只玻璃棒，玻璃棒直径5 mm，长度15 cm，在37 ℃恒温箱厌氧环境下（80% N₂、15% CO₂、5% H₂）培养48 h，将试管从恒温箱中取出，轻轻地用生理盐水冲洗3次，每次3～5 s，用0.1 mol/L的NaOH溶液在振荡器上轻轻地将黏附的变形链球菌洗脱下来，然后在2 500 r/min的速率下离心15 min，收集细菌加入4 mL生理盐水，混匀，在紫外可见分光光度计下测量450 nm处A值。每支试管重复测量3次，以减小误差，结果取平均值，计算黏附抑制率。

黏附抑制率＝1－样品组A值 / 对照组A值

准确称取K₂HPO₄•3H₂O 22.2 g、KH₂PO₄ 7.26 g、MgSO₄ 0.2 g和尿素1.8 g，加蒸馏水溶解定容至1 L（pH 7.1）配制成PUM缓冲溶液备用。取备用菌株，每支试管中加入5 mL含不同质量浓度（20、50、200、500 μg/mL）甜茶苷或木糖醇的菌液，对照组加入5 mL含PUM缓冲溶液的菌液，每组4个平行管。碳氢化合物法（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）测定变形链球菌的表面疏水率。各试管菌液轻轻摇晃混匀，在37 ℃水浴箱中加热15 min，取出其中5 mL加入新试管，每支试管加入400 μL十六烷，超声震荡15 s，使各管充分混匀，然后室温下静置使之分层，上层为油层，下层为水层，弃油层，用紫外可见分光光度计测量在660 nm处A值，各试验管重复测定3次，结果取平均值，计算变形链球菌表面疏水率。

表面疏水率＝ (加入十六烷后A值－初始A值) / 加入十六烷后A值

取备用菌液1 mL分别加入盛有5 mL体积分数为10% 甜茶苷、木糖醇的TSBYE溶液的试管中，在37 ℃恒温箱厌氧环境下（80% N₂、15% CO₂、5% H₂）培养48 h。室温下离心，收集上清，加入硫酸铵固体，置于4 ℃冰箱静置过夜，隔夜取出离心弃上清，将沉淀物中加入磷酸盐缓冲溶液透析至无NH₃检出，室温下离心，上清液即为游离型GTF粗提物。

将GTF粗酶加入双蒸水，用Bradford法测定蛋白的量。将GTF粗提物，含蔗糖体积分数为5%的磷酸钠缓冲溶液，于37 ℃恒温箱厌氧环境下（80% N₂、15% CO₂、5% H₂）培养1～2 h，放入100 ℃的热水10～15 min终止反应，加入双蒸水，室温下离心，上清液中的还原糖用DNS法测定。蒸馏水将沉淀物洗2次，加入NaOH再洗2次，室温离心弃上清，沉淀即为WIG，加入0.1 mol/L NaOH溶解，用蒽酮法测定试管中WIG的量。GTF活力单位定义为标准条件下反应1 h，每分钟从蔗糖释放1 μmol还原糖所需要的酶量，计算酶比活力（酶比活力＝酶活力/总蛋白量）。

采用SPSS 13.0软件进行数据分析和处理，组间比较采取单因素方差分析（ANOVA）；采用Student Newmen Keuls检测进行样本组间均数的两两比较，变量之间的相关分析采用t检验。

变形链球菌经甜茶苷作用后产酸能力明显下降，∆pH值仅为0.036±0.061，与对照组∆pH值（2.913±0.032）比较明显降低（P＜0.01），但在本实验中木糖醇可能由于未达到其有效的最小抑酸浓度，并未显现明显的抑制作用，木糖醇组的∆pH值为2.773±0.405（P＞0.05）。结果可以看出甜茶苷对变形链球菌的产酸能力具有显著的抑制作用。

不同质量浓度甜茶苷对变形链球菌黏附能力的影响通过其菌液在450 nm处的A值的大小来表示，数值越大表明管中的变形链球菌越多，反之则越少，其结果见表 1。甜茶苷各组对变形链球菌的黏附抑制率随着质量浓度的升高而增加，呈正比关系。

表 1(Table 1)

表 1 甜茶苷对变形链球菌黏附能力的影响 (±s，n=3) Table 1 Effect of rubusoside on adhesion of S. mutants (±s，n=3) 组别 ρ / (μg·mL−1) A450值 黏附抑制率 / % 对照 — 135.124±24.482 — 甜茶苷 20 100.937±29.372 25.30 50 41.413±11.276* 69.35 200 1.074± 0.089** 99.21 500 0.467± 0.041** 99.65 木糖醇 20 95.257± 7.648 29.51 50 45.227± 5.793* 66.53 200 1.172± 0.075** 99.13 500 0.535± 0.048** 99.60 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group,same as below

表 1 甜茶苷对变形链球菌黏附能力的影响 (±s，n=3) Table 1 Effect of rubusoside on adhesion of S. mutants (±s，n=3)

甜茶苷对变形链球菌表面疏水率的影响通过菌液于660 nm处的A值大小来表示，数值越大，表示其表面疏水率越小，反之则越大。根据表 2结果显示，甜茶苷组与木糖醇组对表面疏水率的影响随着质量浓度的增加而提升，甜茶苷组表面疏水率与对照组比较显著降低（P＜0.01），且甜茶苷作用强度大于木糖醇。

表 2(Table 2)

表 2 甜茶苷对变形链球菌疏水率的影响 (±s，n=3) Table 2 Effect of rubusoside on hydrophobic rate of S. mutants (±s，n=3) 组别 ρ / (μg·mL−1) A660值 疏水率 / % 对照 — 0.227±0.069 54.60 甜茶苷 20 0.289±0.024 41.60 50 0.301±0.015* 39.19 200 0.307±0.018* 37.98 500 0.413±0.102** 16.56 木糖醇 20 0.212±0.013 57.17 50 0.297±0.028* 40.60 200 0.301±0.068* 39.19 500 0.368±0.037** 25.66

表 2 甜茶苷对变形链球菌疏水率的影响 (±s，n=3) Table 2 Effect of rubusoside on hydrophobic rate of S. mutants (±s，n=3)

甜茶苷、木糖醇对GTF活力和WIG合成的影响见表 3。甜茶苷组的总蛋白的量、酶活力以及比活力相对于对照组各项指标有显著性差异（P＜0.05、0.01）。实验结果表明，变形链球菌在甜茶苷的影响下，GTF活力明显下降，说明甜茶苷对变形链球菌葡GTF活力有强烈的抑制作用。同时变形链球菌在甜茶苷的影响下，WIG合成受到明显抑制。

表 3(Table 3)

表 3 甜茶苷对变形链球菌GTF活力和WIG合成的影响 (±s，n=3) Table 3 Effect of rubusoside on GTFviability and WIG synthesis of S. mutans (±s，n=3) 组别 酶活力 / mU 总蛋白量 / μg 比活力 / (×103 mU·μg−1) WIG / (μg·mL−1) 对照 23.77±0.49 47.35±6.21 0.50±0.05 17.212±6.327 甜茶苷 0.41±0.09** 59.60±5.83* 0.01±0.01** 8.371±2.330 木糖醇 11.98±0.71** 42.69±7.18 0.27±0.04** 15.323±2.907

表 3 甜茶苷对变形链球菌GTF活力和WIG合成的影响 (±s，n=3) Table 3 Effect of rubusoside on GTFviability and WIG synthesis of S. mutans (±s，n=3)

研究表明，变形链球菌首先通过黏附于牙齿表面形成菌斑，随后在新陈代谢过程中产生大量酸液，同时利用GTF以合成葡聚糖，以及水不溶性胞外多糖特别是WIG，这是变形链球菌最主要的致龋毒力因子^[8]。因此针对这几个方面来进行考察，找到合适的预防龋齿的作用靶点。变形链球菌通过发酵口腔中多种碳水化合物的残渍而产生大量酸液直接对牙表面进行腐蚀，而其本身也依然能稳定生存于pH值为4.5的口腔环境中，从而产生龋齿，因此对于控制变形链球菌的产酸能力是抑制其产生龋齿的重要环节^[9]。从产酸的实验结果来看，甜茶苷组较对照组，其pH值变动量非常小，说明其对变形链球菌产酸能力有强烈的抑制作用。

通过抑制黏附的实验结果表明，随着质量浓度的升高甜茶苷的黏附抑制率随之升高，在200 μg/mL时黏附抑制率达到99%以上。变形链球菌的选择性黏附是与细胞壁成分密切相关的，细胞壁主要成分是脂磷壁酸和蛋白，脂磷壁酸是GTF在变形链球菌表面的受体，它通过促进葡萄糖基转移酶和细菌表面的结合来调节对于牙齿表面的黏附效果^[10]。高分子表面蛋白抗原是目前研究比较多的变形链球菌的黏结素，所谓黏附作用，就是黏结素与生物膜中受体成分的特异性结合^[11]。而对于表面疏水率的实验结果表明，甜茶苷质量浓度逐渐升高其表面疏水率逐渐降低，表明其对于变形链球菌的表面疏水率有一定的抑制作用。综合2个实验结果推断，甜茶苷对变形链球菌黏附作用的抑制，主要是针对黏结素表面高分子蛋白，降低GTF活力影响脂磷壁酸与受体结合能力以及其对于表面疏水率控制所导致的，但其具体抑制机制还需深入研究。

GTF是公认的致龋菌毒力因子，变形链球菌产生的GTF可以利用蔗糖为底物合成胞外多糖，其中包括水不溶性胞外多糖WIG，而WIG是黏附的关键因素之一，因此抑制合成WIG的关键酶GTF的活性，是研究治龋的核心之一^[12]。通过对GTF活力测试的实验结果表明，甜茶苷对GTF酶活性有显著的抑制能力，其能力要强于木糖醇组。本实验还对变形链球菌菌液中的总蛋白的量进行测定，结果表明甜茶苷组蛋白质的量要明显高于木糖醇组和对照组，根据文献报道^[13]，甜茶苷水解产物中含有18种氨基酸，其中谷氨酸的量高达12.56 mg/g，这些氨基酸可能被变形链球菌作为底物合成蛋白质，从而导致甜茶苷组总蛋白质的量增高。

WIG的合成是细菌的一种保护性生长方式，同时也是变形链球菌在口腔内生存致龋的重要条件之一，是牙菌斑聚集和发展的重要因素，因此本实验也对WIG进行了测定^[14]。结果表明甜茶苷作用下的菌液中WIG的量要明显低于对照组以及木糖醇组，其抑制了GTF的活性，则GTF的量也随之减少，GTF活性与WIG量之间呈正相关关系。

综上所述，甜茶苷对变形链球菌产酸能力、黏附能力、GTF活力以及WIG合成能力有较强的抑制作用，可期望其在龋齿防治领域成为一种有应用前景的药物。