柴胡是中医临床常用中药，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效，主要用于治疗感冒发热、寒来暑往、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等^[1]。《中国药典》2010年版收载的柴胡分别来自伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡B. scorzonerifolium Willd. 的干燥根，前者药材习称“北柴胡”，后者称“南柴胡”或“红柴胡”。本课题组之前的研究^[2]和已有文献报道^[3,4,5]均提示柴胡和狭叶柴胡在化学成分上存在差异，柴胡中柴胡皂苷a、d的量高于狭叶柴胡^[3]，2种柴胡挥发性成分的量^[4]、组成^[5]均不相同，二者的初级代谢物差异也比较明显^[2]。但在临床运用中，两者经常不加区别混用。将不同的柴胡配伍到同一复方中，对全方其他成分的煎出是否影响，目前尚不清楚。

柴葛解肌汤（Chaige Jieji Decoction，CJD）出自明•陶华《伤寒六书》，由柴胡、葛根、黄芩、白芍、羌活、白芷、桔梗、石膏、生姜、大枣和甘草组成，用于感冒风寒、寒郁化热、火郁重、恶寒轻、头痛肢楚、目痛鼻干、心烦不眠、眼眶痛、苔薄黄、脉浮等症^[6]。柴胡是柴葛解肌汤的君药，因此，本研究选择柴葛解肌汤对这一问题进行研究。目前，柴葛解肌汤在临床应用方面的文献较多^[6,7,8]，对其药效或指标成分定量测定的报道较少，且已有文献只对芍药苷或葛根素进行定量测定^[9,10]，评价指标较单一。因此，本研究建立柴葛解肌汤的HPLC多成分同时测定方法，并以这些成分为指标对柴胡、狭叶柴胡配伍的复方（柴葛解肌汤）进行比较，为柴胡、狭叶柴胡的临床应用提供研究依据。

Waters e2695高效液相色谱仪，2489 UV/Vis Detector；Agilent C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；Empower 3色谱工作站；CPA225D十万分之一分析天平、BSA124S万分之一分析天平，SI德国赛多利斯公司。

对照品甘草苷（批号111610-201005，质量分数为94.9%）、黄芩苷（批号110715-200212，质量分数＞99%），购自中国食品药品检定研究院；黄芩素（批号121227，质量分数＞99%）、汉黄芩苷（批号121130，质量分数＞99%），购自上海融合医药科技有限公司；葛根素（批号3681-99-0，质量分数＞98%），购自Asenal公司；芍药苷（批号23180-57-6，质量分数＞98%）、芍药内酯苷（批号39011-90-0，质量分数＞98%），购自上海盛中医药化工有限公司。

中药材柴胡、葛根、黄芩、白芷、生姜、白芍、桔梗、羌活、甘草、大枣和石膏末共11味药，柴胡购自山西陵川，狭叶柴胡购自河北安国，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定，为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 和狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根，留样于山西大学，编号分别为CH-7和CH-8；其余药材购自山西华源制药集团，经山西大学秦雪梅教授鉴定分别为豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根、唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. 的干燥根、姜科植物姜Zingiber offcinale Rosc. 的根茎、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根、桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. 的干燥根、伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang的干燥根茎、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根、鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill. 的干燥成熟果实和硫酸盐类矿物硬石膏族石膏Gypsum Fibrosum。分析甲醇，北京化工厂；色谱乙腈，Fisher公司；娃哈哈纯净水。

柴葛解肌汤样品的制备：根据处方分别称取柴胡或狭叶柴胡（6 g）、葛根（9 g）、黄芩（6 g）、石膏（5 g）、羌活（3 g）、桔梗（3 g）、白芍（6 g）、白芷（3 g）、生姜（6 g）、大枣2枚，加入8倍量水，浸泡30 min。武火煮沸后继续煎煮30 min，滤出药汁。二煎，加入5倍量的水武火煎煮至沸腾后改文火煎煮30 min，滤出药汁。合并2次煎煮滤液，浓缩定容至100 mL。

精密称取葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素的对照品适量，用甲醇配制成葛根素0.105 mg/mL、芍药内酯苷0.102 mg/mL、芍药苷0.294 mg/mL、甘草苷0.101 mg/mL、黄芩苷0.170 mg/mL、汉黄芩苷0.475 mg/mL和黄芩素0.121 mg/mL的混合对照品贮备液。

取柴葛解肌汤样品1mL，加甲醇定容至5 mL，涡旋，离心，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

按处方比例及“柴葛解肌汤样品的制备”及“2.2”项下方法分别制备缺葛根阴性样品、缺白芍阴性样品、缺甘草阴性样品和缺黄芩阴性样品。

Agilent C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；柱温25 ℃；流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱条件：0～15 min，20%～44% A；15～20 min，44%～52% A；体积流量0.8 mL/min；进样量10 μL；检测波长230 nm。

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样测定，色谱图见图 1，各个阴性样品在被检测物色谱峰处均无干扰。

图 1

Fig. 1

1-葛根素 2-芍药内酯苷 3-芍药苷 4-甘草苷 5-黄芩苷 6-汉黄芩苷 7-黄芩素 1-puerarin 2-albiflorin 3-paeoniflorin 4-liquiritin 5-baicalin 6-wogonoside 7-baicalein图 1 混合对照品 (A)、供试品 (B)、缺葛根阴性样品 (C)、缺白芍阴性样品 (D)、缺甘草阴性样品 (E)、缺黄芩阴性样品(F) 的HPLC图谱 Fig. 1 HPLCof mixture reference substances(A),testingsolution (B),negative sample without Puerariae Lobatae Radix (C),negative sample without Paeoniae Alba Radix (D),negative sample without Glycyrrhizae Radix (E),and egative sample without Scutellariae Baicalensis Radix (F)

将混合对照品溶液稀释至系列质量浓度，分别平行进样2次，取峰面积的平均值作标准曲线，进行线性考察。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素的回归方程和线性范围。葛根素Y＝2.2×10⁷ X＋4.6×10⁵，r＝0.999 1，线性范围0.011～0.105 mg/mL；芍药内酯苷Y＝2.3×10⁷ X＋87 604，r＝0.999 0，线性范围0.010～0.102 mg/mL；芍药苷Y＝2.3×10⁷ X＋2.5×10⁵，r＝0.999 0，线性范围0.029～0.294 mg/mL；甘草苷Y＝2.4×10⁷ X＋80 497，r＝0.999 2，线性范围0.010～0.101 mg/mL；黄芩苷Y＝1.5×10⁷ X＋8.8×10⁵，r＝0.999 1，线性范围0.017～0.170 mg/mL；汉黄芩苷Y＝1.7×10⁷ X－43 106，r＝0.999 7，线性范围0.048～ 0.475 mg/mL；黄芩素Y＝3.4×10⁷ X－38 400，r＝0.999 4，线性范围0.012～0.121 mg/mL。

取同一供试品溶液，进样10 μL，连续进样6次，记录峰面积。葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD分别为1.6%、1.9%、1.5%、1.6%、1.3%、0.3%、1.6%，表明仪器精密度良好。

制备柴葛解肌汤样品6份，并分别按供试品溶液制备方法制备6份，在上述实验条件下进样，记录峰面积，计算其质量分数及RSD。葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素的平均质量分数分别为0.067、0.053、0.167、0.067、1.337、0.282、0.094 mg/g，RSD分别为1.7%、1.9%、1.7%、1.7%、1.4%、0.8%、1.6%。

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12 h进样10 μL，记录峰面积，葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素的峰面积的RSD分别为1.5%、1.8%、1.9%、1.4%、1.0%、1.3%、0.9%。表明供试品溶液中上述7种成分在12 h内稳定性良好。

精密量取已测定的同一柴葛解肌汤样品9份，每份1 mL，分别精密加入一定量的葛根素对照品溶液，定容至5 mL，配制成高、中、低不同质量浓度样品溶液，每个质量浓度制备3份。在上述条件下进样测定，进行回收率试验。同法测定芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素回收率。结果7种成分的平均回收率在94.1%～106.6%，RSD在0.3%～1.9%，表明加样回收率试验结果良好。

采用上述已建立的方法，按“柴葛解肌汤样品的制备”及“2.2”项下分别制备柴胡和狭叶柴胡配伍的样品6份，按HPLC色谱条件进样。测得葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素7种成分的量见表 1。并对不同成分做t检验，结果显示2种不同来源柴胡配伍的柴葛解肌汤中这7种成分的量没有显著性差异（P＞0.05）。

表 1(Table 1)

表 1 不同来源柴胡配伍的柴葛解肌汤的7种成分的定量测定 (±s，n=6) Table 1 Determination of seven compounds in CJD composed of Bupleuri Radix from different sources (±s，n=6) 样品 质量分数 / (mg∙g-1) 葛根素 芍药内酯苷 芍药苷 甘草苷 黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 含柴胡的柴葛解肌汤 0.067±0.001 0.053±0.001 0.167±0.003 0.067±0.001 1.337±0.019 0.282±0.002 0.094±0.001 含狭叶柴胡的柴葛解肌汤 0.064±0.001 0.054±0.001 0.166±0.002 0.067±0.001 1.328±0.023 0.282±0.005 0.091±0.002 P值 0.28 0.49 0.71 0.65 0.65 0.95 0.06

表 1 不同来源柴胡配伍的柴葛解肌汤的7种成分的定量测定 (±s，n=6) Table 1 Determination of seven compounds in CJD composed of Bupleuri Radix from different sources (±s，n=6)

在建立柴葛解肌汤7种成分定量测定方法时，对于流动相的选择，在文献报道^[9,10,11,12]基础上，比较了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-1%冰乙酸水溶液等洗脱溶剂，最后选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，可以达到满意的分离效果。关于检测波长的选择，本实验对7个分析物对照品进行了PDA全波长扫描，发现各组分的最大吸收波长分别为：葛根素248 nm、芍药内酯苷和芍药苷231 nm、甘草苷276 nm、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素276 nm。而在230 nm处各化合物均有较大响应值，且分离度良好，故选择230 nm作为检测波长。

柴胡为柴葛解肌汤的君药，本研究结果显示柴胡和狭叶柴胡分别配伍的柴葛解肌汤中，葛根素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素的量均无显著性差异。然而，柴葛解肌汤的化学成分非常复杂，本研究只对7种指标成分进行了比较，不同的柴胡配伍后对其他成分的影响值得进一步研究。此外，已有文献报道狭叶柴胡和柴胡在药理活性上存在显著差异^[13]，狭叶柴胡挥发油的解热作用明显大于柴胡，而柴胡的保肝作用要优于狭叶柴胡；本课题组前期也比较了柴胡和狭叶柴胡在解热、抗炎、镇痛及保肝等方面的药效^[14]，结果显示，柴胡的抗炎镇痛作用强于狭叶柴胡，而狭叶柴胡的解热作用优于柴胡。此外，对于柴胡和狭叶柴胡分别配伍的逍遥散抗抑郁作用^[15]，本课题组研究发现狭叶柴胡组成逍遥散的抗抑郁作用及起效时间略优于柴胡。因此，不同柴胡配伍的柴葛解肌汤复方的药理作用是否存在差异，下一步将进行深入研究。