中草药  2014, Vol. 45 Issue (11): 1577-1584
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茯苓及其化学拆分组分学习记忆及镇静催眠的性味药理学研究
徐煜彬, 徐志立, 李明玉, 窦德强     
辽宁中医药大学药学院, 辽宁 大连 116600
摘要目的 评价茯苓及其拆分组分的活性,并结合中医传统理论对其进行性味归属。方法 采用东莨菪碱造成小鼠记忆障碍并应用Morris水迷宫实验,观察茯苓及其组分对学习记忆的影响,同时应用抖笼法及戊巴比妥钠协同催眠实验来观察茯苓及其组分的镇静催眠作用。结果 茯苓水煎液(生药8.56 g/kg)、醋酸乙酯组分、石油醚组分、粗多糖组分及精制多糖组分均能明显缩短小鼠到达平台的潜伏期,并且降低东莨菪碱所致记忆障碍小鼠大脑乙酰胆碱酯酶(AchE)活性,醇洗物与水洗物对潜伏期的影响不明显,各个组分对于小鼠的脑指数均有不同程度的增加;生药42.8 g/kg茯苓水煎液可显著延长阈上剂量戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间,而对小鼠睡眠潜伏期没有影响;茯苓粗多糖能显著缩短小鼠的睡眠潜伏期,并且与精制多糖组分均能显著延长小鼠睡眠时间,醋酸乙酯组分作用次之。结论 茯苓改善学习记忆和镇静催眠作用都与其味甘入脾能健脾宁心相关,其醋酸乙酯、石油醚及多糖拆分组分可能为其甘味的物质基础。
关键词茯苓     拆分组分     学习记忆     镇静催眠作用     物质基础     性味归经    
Nature and flavor pharmacology of Fuling and its components for learning and memory improvement as well as sedative and hypnotic effects
XU Yu-bin, XU Zhi-li, LI Ming-yu, DOU De-qiang    
College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China
Abstract: Objective To evaluate the activities of Fuling (the dried sclerotium of Poria cocos) and its components, then its nature and flavor were attributed by traditional Chinese medicine (TCM) theory. Methods Scopolamine was used to cause learning and memory impairment in mice, and Morris water maze test was used to observe the effects of Fuling and its components on learning and memory of mice, and shaking cage method and pentobarbital sodium were used to evaluate the sedative and hypnotic effects of Fuling and its components. Results Water decoction of Fuling (crude drug 8.56 g/kg), ethyl acetate, petroleum ether, crude polysaccharides, and refined polysaccharides components could significantly shorten the latency of scopolamine-induced memory impairment in mice to reach the platform;Acetylcholinesterase activity in mice brain was decreased, the effects of the components washed with alcohol and water on latency were less obvious and the individual components of the cerebral index showed an increase in different proportions;Crude drug (42.8 g/kg) water decoction of Fuling could significantly prolong the sleeping time, but had no effect on sleep latency;Crude polysaccharides could significantly shorten the sleep latency while the refined polysaccharides could significantly increase sleeping time;Followed by ethyl acetate components, the petroleum ether components showed a weak antagonistic effect. Conclusion The learning and memory improvement as well as the sedative and hypnotic effects are associated with Fuling's sweet taste which can tonify spleen to calm nerves;The ethyl acetate, petroleum ether, and polysaccharides components are the basic materials of sweet taste.
Key words: Fuling [dried sclerotium of Poria cocos (Schw.) Wolf]     components     learning and memory     sedative and hypnotic effect     basic materials     nature and flavor tropism    

茯苓(Poria,Fuling)为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf 的干燥菌核,具有利水渗湿、健脾宁心等作用[1]。《日华子本草》记载“补五劳七伤,走胎,暖腰膝,开心益智,止健忘,忌醋及酸物”。《神农本草经》记载“味甘,平。主胸胁逆气。忧恚,惊邪恐悸,……久服安魂魄养神”。说明茯苓具有益智、改善记忆、宁心安神的作用。目前关于含有茯苓的组方对改善记忆的研究已有报道,Zhang等[2]发现远志和茯苓水提液能明显缩短化学药所致记忆障碍小鼠Morris水迷宫的逃避潜伏期,并能降低乙酰胆碱酯酶(AchE)的活力;吴红彦等[3]和Shi等[4]发现含有茯苓的黑逍遥散能显著降低小鼠脑内AchE活性,并增强胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性,张敏等[5]和卢建中等[6]分别通过跳台法和Morris水迷宫法发现茯苓水提液能改善学习记忆,但对单味茯苓及其组分改善记忆的作用机制研究较少。中枢胆碱能系统功能正常是正常学习记忆功能的生理基础,抗胆碱药或拟胆碱药可分别加重或改善学习记忆障碍[7]。研究表明,抗胆碱药物东莨胆碱能使小鼠的记忆发生障碍,因此其是公认的制备学习记忆障碍模型的药物[8, 9, 10]

中药发挥药效可能是多个不同的组分,也可能是单个组分,基于其复杂,不可控等特点[11, 12],本实验对茯苓进行了组分拆分,采用Morris水迷宫模型,东莨菪碱造成小鼠学习记忆障碍模型[13]和抖笼法[14, 15]及戊巴比妥钠协同催眠实验[16, 17],并首次采用脑指数和AchE活性对茯苓及其拆分组分的活性进行综合评价,期望能结合中药的组分结构特点及茯苓性味特点对组分改善记忆进行深入的讨论,以发现茯苓改善学习记忆障碍的有效组分,阐述茯苓的“质-性-效”关联,从而揭示茯苓的物质基础与性效关系,为茯苓各拆分组分对记忆的影响建立一个初步的评价体系。

1 材料 1.1 实验动物

昆明种小鼠,雌雄各半,体质量18~22 g,由大连医科大学动物实验中心提供,合格证号SCXX(辽)2008-0002。

1.2 仪器

FD—EA—50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);M1型Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司);UV2100紫外可见分光光度(上海尤尼柯仪器有限公司);RM6240 BD型抖笼换能器(成都仪器厂)。

1.3 药品及试剂

茯苓,2012年11月收集于云南省腾冲县,经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核;吡拉西坦片(批号20120532,华中药业股份有限公司);东莨菪碱(批号120802,上海禾丰制药厂);D-101型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);AchE试剂盒(南京建成生物工程研究所);戊巴比妥钠(批号556178-100,上海试剂二厂)。

2 方法 2.1 茯苓组分的拆分[18, 19, 20]

采用水蒸气蒸馏法,获得茯苓挥发油组分。茯苓水煎液减压浓缩至100 mL,加95%乙醇使醇沉体积分数为80%,0~5 ℃放置过夜;离心(8 000 r/min,10 min),收集上清液和沉淀,沉淀加少量水溶解,水浴挥至无醇味,再加水至100 mL,加95%乙醇调乙醇体积分数至80%,0~5 ℃放置过夜;离心(8 000 r/min,10 min),收集沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤直至无颜色,沉淀冷冻干燥,即得茯苓粗多糖组分(得率0.66%)。将上清液减压浓缩,水浴挥至无醇味,加水至100 mL,依次用石油醚、醋酸乙酯萃取直至颜色明显变浅或无色得石油醚萃取物I和醋酸乙酯萃取物I。余下水层挥至无醋酸乙酯味,加水至100 mL,通过D-101大孔吸附树脂柱色谱(上样量为生药材-湿树脂1 g∶3 mL),洗脱溶剂依次为水、95%乙醇,分别洗脱至无色,收集相应的洗脱液,树脂水洗物冻干,即得树脂水洗组分。95%醇洗物浓缩至25 mL,依次用石油醚、醋酸乙酯萃取直至无色,得到石油醚萃取物II、醋酸乙酯萃取物II和树脂醇洗物,冷冻干燥,得到树脂醇洗组分。由于挥发油的量极少,并且用HPLC-ELSD检测得到的图谱中挥发油与石油醚萃取物有重叠的部分,因此,将茯苓中挥发油与石油醚萃取物I和II合为一个组分,即为石油醚萃取组分;醋酸乙酯萃取物II与醋酸乙酯萃取物I合并为醋酸乙酯萃取组分。精制多糖的拆分:称取适量粗多糖,进行常规Sevag法除蛋白,即得精制多糖组分(得率0.18%)。

对各组分代表性成分的分析结果表明石油醚组分(得率0.02%)主要含有芳香酯类化合物,醋酸乙酯组分(得率0.09%)主要为三萜类成分,树脂水洗组分(得率1.69%)含有无机盐、小分子糖等,而树脂醇洗组分(得率0.28%)含有氨基酸、聚炔类成分。

2.2 茯苓及拆分组分改善学习记忆作用的研究 2.2.1 不同剂量茯苓对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠的影响[2, 13, 21]

根据Morris水迷宫前期预试验结果确定茯苓低、中、高剂量,取65只小鼠,每天Morris水迷宫训练1次,训练3 d,排除差异性特别大的小鼠。取60只小鼠进行随机分组,分为对照组,模型组,吡拉西坦阳性组(0.686 g/kg),茯苓水煎液低、中、高剂量(生药2.14、4.28、8.56 g/kg,《中国药典》2010年版中规定茯苓给药量为15 g,折算小鼠的给药量为2.14 g/kg)组,各组均ig给药,给药体积为0.1 mL/10 g。实验第1~3天,除对照组和模型组ig给予等量生理盐水外,其他各组小鼠固定时段ig给药1次,随后4 d在Morris水迷宫测试前1 h ig给药,0.5 h前除对照组ip生理盐水外,其余各组均ip东莨菪碱2 mg/kg。在第7天,Morris水迷宫测试结束后,立即将小鼠处死,取大脑制成脑匀浆,离心,取上清液进行AchE活性测定。

2.2.2 茯苓拆分组分对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠的影响[2, 13, 21]

取105只小鼠,每天Morris水迷宫训练1次,训练3 d,排除差异性特别大的小鼠,根据“2.2.1”项实验结果,茯苓水煎液生药8.56 g/kg为改善记忆障碍的有效剂量(相当于临床用量的4倍),故各化学拆分组分按其在生药中的量的4倍量给予实验动物,给药体积为0.1 mL/10 g,模型组和对照组给予等体积的生理盐水。取100只小鼠随机分组,分为对照组、模型组、吡拉西坦阳性组(0.686 g/kg)、石油醚组、醋酸乙酯组、树脂醇洗组、树脂水洗组、粗多糖组、精制多糖组、茯苓水煎液(生药8.56 g/kg)组。实验方法及检测指标同“2.2.1”项。

2.3 茯苓及拆分组分对镇静催眠作用的研究 2.3.1 不同剂量茯苓对小鼠镇静催眠作用

采用抖笼法观察镇静作用。根据前期预试验结果确定茯苓低、中、高剂量(生药10.7、21.4、42.8 g/kg),取40只小鼠随机分组,分别为对照组,茯苓低、中、高剂量组,每只小鼠开始实验时,先进笼适应2 min,随后记录20 s曲线,对每个实验记录段求振幅的平均值,对照组ig给予生理盐水0.25 mL/10 g,茯苓低、中、高剂量组小鼠分别ig茯苓水煎液,描记给药后1 h小鼠活动波形,并求算振幅平均值[14, 15]

戊巴比妥钠协同催眠实验:取40只小鼠随机分组,分为对照组,茯苓低、中、高剂量(生药10.7、21.4、42.8 g/kg)组,对照组ig给予生理盐水0.25 mL/10 g,茯苓低、中、高剂量组小鼠分别ig茯苓水煎液,连续给药7 d,于末次给药前8 h禁食,前1 h禁水,给药0.5 h后ip戊巴比妥钠溶液80 mg/kg(阈上剂量),记录各组小鼠睡眠潜伏期和持续时间。另取40只小鼠随机分组,分组及给药方法同上,给药0.5 h后ip戊巴比妥钠溶液50 mg/kg(阈下剂量),记录各组发生睡眠的小鼠数量[16, 17]

2.3.2 茯苓拆分组分对小鼠镇静催眠作用[16, 17]

根据“2.3.1”项实验结果,茯苓水煎液生药42.8 g/kg为镇静催眠的有效剂量,各化学拆分组分按其在生药中量的20倍量给予实验动物,给药体积为0.2 mL/10 g,对照组给予等体积的生理盐水。戊巴比妥钠协同催眠实验:取80只小鼠随机分组,分为对照组、石油醚组、醋酸乙酯组、粗多糖组、精制多糖组、水洗物组、醇洗物组、茯苓水煎液(42.8 g/kg)组,连续给药7 d,按“2.3.1”项方法进行戊巴比妥钠阈上剂量和阈下剂量协同实验。

2.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件,计量资料均以x±s表示,组间比较采用t检验。计数资料采用χ2检验。

3 结果 3.1 茯苓及拆分组分对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠的影响 3.1.1 茯苓对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠的影响

给予东莨菪碱后,模型组小鼠逃避潜伏期明显延长,模型组与对照组比较差异非常显著(P<0.01),说明造模成功,东莨菪碱所致小鼠记忆障碍模型稳定可靠。高剂量茯苓水煎液能明显缩短模型小鼠2 min内达到终点平台的潜伏期,而且随着时间的延长,趋势也越来越明显,从低、中、高3个剂量来看,随着药物浓度的提高,潜伏期也越来越短,见表 1。高剂量茯苓水煎液能显著增加模型小鼠在平台所在象限的时间和行程(图 1)。高剂量茯苓水煎液能明显降低模型小鼠大脑内AchE的活性(P<0.01),并且脑指数显著增加(P<0.01),见表 2

表 1 茯苓对记忆障碍小鼠Morris水迷宫测试结果的影响(x±s,n=10) Table 1 Effect of Fuling on results of Morris water maze test for memory impairment mice (x±s,n=10)

图 1 Morris水迷宫测试小鼠2 min运动轨迹图 Fig. 1 Trajectory chart of mice in 2 min in Morris water maze test

表 2 茯苓对记忆障碍小鼠脑组织AchE活性和脑指数的影响(x±s,n=10) Table 2 Effect of Fuling on AchE activity and cerebral index of memory impairment mice(x±s,n=10)
3.1.2 茯苓拆分组分对东莨菪碱所致记忆障碍小鼠的影响

表 3可以看出醋酸乙酯组分和石油醚组分能明显缩短模型小鼠2min内达到终点平台的潜伏期(P<0.01),粗多糖及精制多糖也能明显缩短模型小鼠逃避潜伏期(P<0.01),但作用较醋酸乙酯和石油醚组分弱,醇洗物与水洗物对潜伏期的影响较不明显。而且随着天数的加长,趋势也越来越明显。从表 4可知,醋酸乙酯、石油醚、粗多糖及精制多糖组分能明显降低模型小鼠大脑内的AchE活性(P<0.01)。而各个组分对于小鼠的脑指数均有不同比例的增加。

表 3 茯苓各拆分组分对记忆障碍小鼠逃避潜伏期的影响(x±s,n=10) Fig. 3 Effect of Fuling’s components on escape latency of memory impairment mice (x±s,n=10)

表 4 茯苓各组分对记忆障碍小鼠脑组织AchE活性和脑指数的影响(x±s,n=10) Fig. 4 Effect of Fuling’s components on AchE activity and cerebral indexes of memory impairment mice(x±s,n=10)
3.2 茯苓及拆分组分对小鼠的镇静催眠作用 3.2.1 茯苓对小鼠的镇静催眠作用

表 5可以看出茯苓水煎液单次给药对小鼠的镇静作用极弱。茯苓高剂量组协同阈上剂量戊巴比妥钠明显增加小鼠睡眠时间(P<0.01),同时茯苓高剂量组能显著增加给予阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡动物数量,提高入睡率(P<0.05)。见表 6

表 5 茯苓对小鼠自发活动的影响 (抖笼法,x±s,n=10) Table 5 Effect of Fuling on spontaneous activities of mice (shaking cage method,x±s,n=10)

表 6 茯苓协同戊巴比妥钠对小鼠的催眠作用 (x±s,n=10) Table 6 Effect of Fuling on hypnotic action of mice induced by sodium pentobarbital (x±s,n=10)
3.2.2 茯苓拆分组分对小鼠的催眠作用

粗多糖组分可显著延长小鼠睡眠潜伏期(P<0.01),而石油醚组分表现出一定的兴奋作用,醋酸乙酯组分稍微延长小鼠睡眠时间(P<0.05),粗多糖及精制多糖组分显著延长小鼠睡眠时间(P<0.01)。粗多糖和精制多糖组分能显著增加给予阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡动物数量,提高入睡率(P<0.01、0.05)。见表 7

表 7 茯苓各组分协同戊巴比妥钠对小鼠的催眠作用(x±s,n=10) Table 7 Effect of Fuling’scomponents on hypnotic action of mice induced by pentobarbital sodium(x±s,n=10)
4 讨论 4.1 茯苓改善学习记忆物质基础的确定

大脑中胆碱能系统是学习记忆的重要机制,中枢胆碱能系统功能正常是正常学习记忆功能的生理基础,但是由于其作用机制的复杂性,并且和其他系统如去甲肾上腺能,5-羟色胺能具有交叉性,在临床上拟胆碱能药物治疗作用非常局限[22]。遵循传统中医理论,神经系统都属于脑的范畴,学习记忆障碍自古受到重视,中医多称之为“喜忘”、“健忘”[23],健忘以虚证居多,如精、气、血亏虚,髓海不足,脑失所养等[24]

本实验结果表明茯苓水煎液,石油醚、醋酸乙酯、粗多糖及精制多糖组分能显著降低东莨胆碱所致记忆障碍模型小鼠的AchE,并提高小鼠的脑指数。乙酰胆碱能激活胆碱能M1、M3受体,从而激活蛋白磷脂酶,生成三磷酸肌醇和甘油二脂,打开Ca2+通道,使蛋白磷酸化并且激活CREB,使脑内蛋白因子转录表达,从而影响学习记忆[25]。而钙离子本身作为第二信使,由Ca2+/磷脂依赖性蛋白激酶(PKC)和Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶(CaM II)介导的Ca2+依赖性蛋白磷酸化在神经可塑性中起重要作用,并且在Ras/MAPK/ERK、PLCγ、IP3-K/Akt这几条通路中起着重要的作用[26, 27]。表明茯苓改善东莨菪碱所致学习记忆障碍与降低AchE活性有关,结合中医基础理论“脑为元神之俯”,本实验首次应用脑指数指标进行学习记忆评价,发现具有一定的规律性,能对AchE指标起到补充作用。Lee等[28]发现茯苓总三萜与5-HT3受体有密切的关系,而醋酸乙酯组分主要包含三萜类成分,表明醋酸乙酯组分改善记忆有可能通过AchE和5-HT3受体进行多重调节。Gao等[29]对褐藻素研究发现能显著降低大鼠脑内AchE活力,并增加乙酰胆碱转移酶(ChAT)的活力,表明多糖改善记忆与中枢胆碱能神经系统密切相关,这也间接说明了茯苓粗多糖组分和精制多糖组分改善记忆的作用机制,而石油醚组分主要含有芳香脂类化合物,可能与芳香化合物能提神醒脑有关。各组分对东莨菪碱所致的小鼠脑指数均有不同程度的增加,并且Morris水迷宫测试也显示随着训练天数的延长,醇洗物与水洗物表现出微弱的作用,这可能与改善脑指数有一定关系。粗多糖中含茯苓多糖35.43%,精制多糖中含茯苓多糖22.29%,从研究结果看,给药后二者无显著性差异,说明茯苓多糖也具有显著的改善学习记忆作用。

茯苓味甘入脾,具有健脾宁心的作用,而茯苓的宁心作用主要是健脾来体现的,脾为气血化生之源,脑髓的盈亏与脾密切相关,而脾藏意,在志为思:意,即意念,是将从外界获得的知识通过思维取舍,形成回忆的印象;思,即思考、思虑,是人的精神意识思维活动的一种状态。“心有所忆谓之意”(《灵枢•本神》)。“谓一念之生,心有所向而未定者,曰意”(《类经•脏象类》)。“脾藏营,营含意”(《灵枢•本神》)。上述都表明脾跟意相关,脾气健运,气血化源充足,髓海得养,则意念丰富,思路清晰,记忆力强;反之,脾的运化功能不足,“脾阳不足则思虑短少,脾阴不足则记忆多忘”(《中西汇通医经精义•上卷》)。脾气健运则肺气旺。肺功能正常,气血充足,则髓海有余,肺藏魄:魄是不受内在意识支配而产生的一种能动作用表现,属于人体本能的感觉和动作,即无意识活动,如耳的听觉、目的视觉等,都属于魄的范畴。故曰:“魄之为用,能动能作,痛痒由之而觉也”(《类经•脏象类》)。魄与生俱来,“并精而出入者谓之魄”(《灵枢•本神》)。“肺藏气,气舍魄”(《灵枢•本神》)。故肺气旺盛则体健魄全,魄全则感觉灵敏,耳聪目明,记忆力强盛,动作正确协调。综上所述茯苓宁心功效是通过健脾功效得以实现,改善学习记忆与其甘味入脾起到健脾宁心作用相关,为其甘味作用,由此醋酸乙酯组分、石油醚组分、多糖组分也是其甘味的物质基础。

4.2 茯苓镇静催眠物质基础的确定

《本草分经》:“甘、淡,平。白者入气分,益脾宁心”。《神农本草经百种录》:“味甘,平。主胸胁逆气,忧恚,惊邪恐悸,……久服安魂养神,不饥延年。心脾和通之效”。历代本草表明茯苓具有宁心安神,镇静的功效,茯苓味甘入脾,脾为后天之本,气血生化之源,脾气健运,化源充足、血液充盈则心有所主,心神得安。《素问•逆调论》云:“胃不和则卧不安。”《温病条辨•中焦篇》说:“不寐,中焦湿聚,阻遏阳气不得下交于阴也”。上述都表明了脾与宁心安神的关系,脾运化功能直接影响到心神的充养,另一方面,脾位于中焦,为气机升降出入的枢纽,气机升降正常,营卫运行正常才能心神得安。本实验结合茯苓的性味对茯苓镇静催眠作用进行研究发现,与对照组相比,茯苓高剂量组单次给药,小鼠自发活动明显减少,并且茯苓高剂量组连续ig给药7 d可显著地延长阈上剂量戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间,结合上述中医基础理论表明这可能与茯苓味甘入脾而健脾宁心安神有关。而以茯苓单用有效剂量即高剂量对茯苓各拆分组分进行了平行研究发现粗多糖能显著缩短小鼠的睡眠潜伏期,并且与精制多糖组分都能显著增加小鼠睡眠时间,但是粗多糖作用最强,表明除多糖外蛋白还有一些小分子化合物也对小鼠睡眠有一定的影响,醋酸乙酯也能延长小鼠睡眠时间,但作用较多糖弱。综上所述茯苓镇静催眠作用与其味甘入脾健脾宁心安神作用有关,为其甘味的作用,由此茯苓的醋酸乙酯组分、多糖组分为其甘味的物质基础。

综上,茯苓改善学习记忆及镇静催眠作用与茯苓味甘入脾、健脾宁心有关,为甘味的作用,而茯苓拆分组分中的醋酸乙酯组分、石油醚组分及多糖组分都为其甘味的物质基础。

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