中药配伍为中医用药的基本形式，附子-炙甘草是中药“相畏相杀”配伍应用极具代表性的常用药对。附子大辛大热，功效峻猛但毒性极大，炙甘草味甘，具有调和药性、缓急解毒的作用。《景岳全书》载：“附子之性急，得炙甘草而后缓；附子之性毒，得炙甘草而后解。”研究表明，药效及毒性的变化与配伍前后化学组分的变化密切相关。有研究者推测附子-炙甘草配伍减毒作用机制是由于炙甘草中酸性成分与附子中碱性成分发生结合，使汤液中附子乌头碱的量减少^[1]；据文献报道^{[2, 3]}，附子与炙甘草合煎后，附子乌头碱和炙甘草黄酮类成分的量均有不同程度下降；但对附子配伍炙甘草前后化学成分变化的全面分析报道还较少，未能很好反映中药“多组分”特点。目前常采用化学指纹技术作为中药多组分分析的重要手段，由于附子、炙甘草两者成分种类多，类型复杂，常规紫外测定难以满足组分的全面分析；并且已有研究表明，附子煎煮过程部分生物碱可能转化为无紫外吸收的成分结构，因此，本实验采用HPLC-Q-TOF/MS技术，分别建立附子-炙甘草合煎及附子单煎的化学指纹图谱，对比分析其配伍前后的化学变化规律，以期从化学组分角度揭示中药“相畏相杀”配伍理论的科学实质。

Agilent1200系列高效液相色谱仪（在线真空脱气机-低压二元梯度泵-自动进样器-柱温箱）；Bruker Micro QII—TOF（四级杆-飞行时间质谱）。共收集14批次生附片（购自四川新荷花中药饮片有限公司），经成都中医药大学卢先明教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx. 的子根的加工品；炙甘草（批号110521）购自科伦天然药业有限公司，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根及根茎的炮制加工品。色谱纯乙腈、甲酸（Fisher公司）；实验用水为去离子水（Milli-Q纯水机制备），其余试剂均为分析纯。

附子单煎液：取生附片50 g，置于2 L三颈圆底烧瓶，加15倍量纯水，浸泡30 min，加热回流煎煮，大火煮沸后保持微沸30 min，滤过，减压浓缩至1 g/mL。

附子-炙甘草合煎液：将同一批次炙甘草饮片与14个批次生附片（1∶1），置于2 L三颈圆底烧瓶，加15倍纯水，浸泡30 min，加热回流煎煮，大火煮沸后保持微沸30 min，滤过，减压浓缩至1 g/mL。

移取0.2 mL上述水煎液置于2 mL量瓶中，加水溶解定容，取上清液，0.22 μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，进样。

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：以5 mmol/L醋酸铵水溶液（含0.1%醋酸）为A相，以乙腈（含0.1%甲酸）为B相，梯度洗脱程序：0～35 min，90%～80% A；35～45 min，80%～60% A；45～65 min，60%～50% A；体积流量0.4 L/min；柱温为30 ℃；进样量10 μL。

ESI源毛细管电压：4.5 kV；锥孔电压：25 V；干燥气体积流量为6 L/min；雾化气压力为200 kPa；干燥气温度为180 ℃；质谱记录范围：m/z 150～1 000，正离子模式采集，采样频率0.1 s；数据分析采用Bruker公司的Compass Data Analysis工作站。

根据测得的精确相对分子质量，应用Analyst QS质谱分析软件在规定的误差范围内（误差＜±5×10^-6）计算可能的元素组成，并结合各个成分峰的二级质谱碎片信息和附子生物碱类、炙甘草中三萜皂苷类、黄酮类已知化合物的文献报道，并与自建化学成分数据库进行对比，对色谱峰进行定性分析和化学成分鉴别。

分别取同一附子单煎液和附子-炙甘草合煎液供试品溶液，连续进样6次，测定各成分峰的峰面积，结果各色谱峰峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

平行取附子单煎液和附子-炙甘草合煎液6份，照“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，测得各成分峰的峰面积，结果各色谱峰峰面积的RSD均小于3.0%，表明重复性良好。

分别取同一附子单煎液和附子-炙甘草合煎液供试品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h测定各成分峰面积，结果各色谱峰相对峰面积的RSD均小于3.0%。表明供试品溶液在24 h内较稳定。

附子单煎液和附子-炙甘草合煎液共有模式总离子流图见图 1。将各样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（中国药典委员会2004A版），各批次间指纹图谱相似度均大于0.85。

图 1 14个批次附子单煎液 (A) 和14个批次附子-甘草合煎液 (B) 的共有模式图 Fig. 1 Total mode chromatogram of 14 batches of ALRP decoction (A) and 14 batches of compatibility of ALRP and GRRPM (B)

对附子单煎液进行鉴定分析，共指认出响应值较高的24个峰，鉴定出20种化合物及其结构，结果见表 1。对附子-炙甘草合煎液进行鉴定分析，共指认出响应值较高的38个共有峰进行鉴定分析，共指认出32种化合物及其结构，结果见表 2。

表 1(Table 1)

表 1 附子单煎液HPLC-MS指纹图谱20种化学成分鉴定结果 Table 1 Identification of 20 ingredients in ALRP decoction by HPLC-MS fingerprints 峰号 tR / min 相对分子质量（m/z） 分子式 离子形式 鉴定化合物 1 5.8 424.266 5 C23H37NO6 [M＋H]+ 森布星B 2 6.3 408.269 4 C23H37NO5 [M＋H]+ 塔拉乌头定 3 7.4 500.283 5 C25H41NO9 [M＋H]+ 乌头胺 4 7.9 360.249 9 C22H33NO3 [M＋H]+ 欧乌头碱 5 8.2 358.235 1 C22H31NO3 [M＋H]+ 准葛尔乌头碱 6 9.7 452.261 2 C24H37NO7 [M＋H]+ 去氢翠雀胺 7 10.1 470.273 3 C24H39NO8 [M＋H]+ 次乌头胺 9 13.6 450.284 2 C25H39NO6 [M＋H]+ 易混翠雀花碱 10 14.4 342.167 6 C20H23NO4 [M＋H]+ 附子亭碱 11 15.8 438.284 5 C24H39NO6 [M＋H]+ 新乌宁碱 13 19.4 392.280 9 C23H37NO4 [M＋H]+ 黄草乌碱丁 14 24.3 600.342 5 C33H45NO9 [M＋H]+ 异飞燕草碱 15 33.0 606.296 8 C31H43NO11 [M＋H]+ 10-OH-苯甲酰新乌头胺 16 43.3 590.299 3 C31H43NO10 [M＋H]+ 苯甲酰中乌头胺 18 45.8 558.309 0 C31H57NO9 [M＋H]+ 苯甲酰-3,13-脱氧乌头胺 19 46.3 574.300 8 C31H43NO9 [M＋H]+ 苯甲酰次乌头胺 22 49.1 542.314 4 C31H43NO7 [M＋H]+ 苯甲酰新乌宁碱（胺） 23 49.4 632.311 5 C33H45NO11 [M＋H]+ 新乌头碱 24 51.1 616.317 1 C33H45NO10 [M＋H]+ 次乌头碱 25 51.1 646.328 3 C34H47NO11 [M＋H]+ 乌头碱

表 1 附子单煎液HPLC-MS指纹图谱20种化学成分鉴定结果 Table 1 Identification of 20 ingredients in ALRP decoction by HPLC-MS fingerprints

表 2(Table 2)

表 2 附子-炙甘草合煎液HPLC-MS指纹图谱32种化学成分鉴定结果 Table 2 Identification of 32 ingredients in decoction of compatibility of ALRP and prepared GRRPM 峰号 tR / min 相对分子质量（m/z） 分子式 离子形式 鉴定化合物 源于附子 源于炙甘草 4 3.8 196.123 5 C11H17NO2 [M＋H]+ 棍掌碱 √ 5 4.1 180.092 3 C10H13NO2 [M＋H]+ 去甲猪毛菜碱 √ 6 6.6 378.262 6 C22H35NO4 [M＋H]+ 多根乌头碱 √ 7 7.6 440.261 8 C23H37NO7 [M＋H]+ 9-去羟基森布星A √ 9 8.6 364.245 6 C21H33NO4 [M＋H]+ 16-β-hydroxycardiopetaline √ 10 9.2 424.267 4 C23H37NO6 [M＋H]+ 森布星B √ 11 10.2 408.271 7 C23H37NO5 [M＋H]+ 塔拉定 √ 12 11.1 500.284 2 C25H41NO9 [M＋H]+ 乌头胺 √ 13 11.9 360.250 2 C22H33NO3 [M＋H]+ 欧乌头碱 √ 14 12.4 358.235 5 C22H31NO3 [M＋H]+ 准葛尔乌头碱 √ 15 12.9 330.203 9 C20H27NO3 [M＋H]+ 异叶乌头素 √ 16 14.9 454.278 7 C24H39NO7 [M＋H]+ 附子宁碱 √ 17 17.1 438.283 2 C24H39NO6 [M＋H]+ 新乌宁碱 √ 20 21.6 422.289 2 C24H39NO5 [M＋H]+ 塔拉乌头胺 √ 21 26.0 466.242 5 C24H35NO8 [M＋H]+ 翠雀它明 √ 22 27.0 480.293 5 C26H41NO7 [M＋H]+ 14-O-乙酰新乌宁碱 √ 24 32.9 464.298 8 C26H41NO6 [M＋H]+ 14-O-乙酰塔拉乌头胺 √ 25 33.9 676.258 0 C35H49NO12 [M＋H]+ 素馨（杰斯）乌头碱 √ 26 41.2 466.241 4 C24H35NO8 [M＋H]+ 翠雀它明 √ 27 42.8 855.404 3 C42H64O16 [M＋K]+ 甘草皂苷J2 √ 28 44.4 590.290 4 C31H43NO10 [M＋H]+ 苯甲酰新乌头胺 √ 29 45.3 985.467 8 C48H72O21 [M＋H]+ 甘草皂苷A3 √ 30 46.2 604.310 6 C32H45NO10 [M＋H]+ 苯甲酰乌头胺 √ 31 46.4 257.071 2 C15H12O6 [M＋H]+ 甘草素 √ 32 47.2 574.298 6 C31H43NO9 [M＋H]+ 苯甲酰次乌头胺 √ 33 48.3 558.305 8 C31H57NO9 [M＋H]+ 苯甲酰-3,13-去氧乌头胺 √ 34 51.7 572.319 4 C32H45NO8 [M＋H]+ 14-O-茴香酰新乌宁碱（胺） √ 35 52.2 616.304 7 C33H45NO10 [M＋H]+ 次乌头胺 √ 36 52.2 646.325 9 C34H47NO11 [M＋H]+ 乌头碱 √ 37 52.6 600.314 8 C33H45NO7 [M＋H]+ 异飞燕草碱 √ 38 53.5 866.983 2 C50H85NO11 [M＋H]+ 8-亚油酰-苯甲酰乌头原碱 √ 39 61.8 369.131 7 C21H20O6 [M＋H]+ 甘草宁B √

表 2 附子-炙甘草合煎液HPLC-MS指纹图谱32种化学成分鉴定结果 Table 2 Identification of 32 ingredients in decoction of compatibility of ALRP and prepared GRRPM

由表 1和表 2可知，附子单煎液和附子-炙甘草合煎液中来源于附子的成分均基本属于生物碱类，附子单煎液与附子-炙甘草合煎液中共有11种相同成分。双酯型生物碱为附子主要毒性成分，图 1中，峰23、24、25分别为新乌头碱和次乌头碱、乌头碱成分，图 2中峰35、36为次乌头碱和乌头碱，图 1中3种双酯型乌头碱的峰面积比较发现，附子单煎液中的双酯型生物碱的总量高于附子-炙甘草合煎中的3种成分总量，结合前期的研究^[4]，推断附子配伍炙甘草合煎过程中有大量双酯型生物碱因结合而减少。

本实验基于四级杆-飞行时间质谱联用仪Micro TOF-Q设备的高分辨性和成分定性优势，采用多级裂解和源碰撞诱导解离成分结构解析方式，对各色谱峰进行裂解规律的研究。目前已对附子单煎液24个共有峰进行结构鉴定和归属，已推断20种化合物组成及其结构；首次对附子-炙甘草合煎液38个共有峰进行结构鉴定和归属，已推断32种化合物组成及其结构。

本实验过程中考察了水和甲醇作为样品最终溶剂的适宜性，由于附子煎煮过程脂溶性较大的双酯型生物碱类已经大部分转变为水溶性较强的单酯型生物碱及醇胺，使用水和甲醇等极性溶剂提取得到的化学成分较为类似，使得实验考察中，盐酸-甲醇溶解液和水煎液的HPLC-MS指纹图谱的轮廓比较接近。

本实验过程中发现在相同的分析条件下，同一成分在图 1-A和图 1-B中保留时间存在差异，如森布星B，在图 1-A中保留时间为5.8 min，而图 1-B却为9.2 min，这可能是由于附子与甘草合煎过程中，附子中生物碱成分与甘草皂苷黄酮等成分之间产生分子间作用，形成络合形式，从而引起附子中部分成分在同一色谱分离条件下，色谱峰保留时间差异，该成分间作用也与前期研究发现附子与甘草合煎后产生大量沉积物的现象相吻合^[4]。

目前文献报道^{[5, 6, 7]}，附子指纹图谱研究常需要在流动相中添加适量的十二烷基磺酸钠（SDS）以获取合适的分离度，但这会造成基线的波动且色谱峰峰型较差；另外，为了改善色谱峰型，多数方法需要将流动相的pH值调整到碱性条件，但色谱柱在碱性条件下会缩短使用寿命。本实验采用HPLC- ESI-TOF/MS分析手段，建立起附子配伍炙甘草前后水煎液HPLC-MS化学指纹图谱，避免了流动性中加入SDS和碱液，方法学考察表明该指纹图谱重复性和稳定性均较好。目前还未见对基于附子-炙甘草配伍合煎液HPLC-MS指纹图谱的化学成分整体分析，故本实验中附子-炙甘草合煎液HPLC-MS指纹图谱的建立为深入寻找附子有效（毒）物质基础及探明其物质基础在配伍炙甘草合煎过程的变化奠定基础。