白桦脂酸（betulinic acid，BA）是从白桦树皮、蒲桃树叶、夏枯草、滇刺枣仁等药用植物分离得到的五环三萜类化合物^[1,2]，具有抗肿瘤、抗HIV、抗疟、抗炎等多种生物学活性，尤其是对黑色素瘤细胞（Mel-1、Mel-2和Mel-4）具有专一的细胞毒性，不损伤正常细胞^[3,4]，作为一种潜在的治疗黑色素瘤药物极具开发前景。然而，BA不溶于水以及相对较大的相对分子质量（M_W 456.71）限制了其经皮给药^[5]。而纳米粒、脂质体、纳米乳等纳米给药系统可增加药物透皮速率，延长停留时间。其中醇质体（ethosomes）是一种新型的含有一定量小分子醇且具有囊泡结构的纳米给药载体，主要用于经皮给药，具有流动性及变形性强、包封率高、稳定性好、刺激性小等优点^[6,7,8]。通过柔性强的醇质体膜结构，携带药物直接穿透角质层，同时醇质体上的磷脂也可与角质层上的脂质发生融合，促进药物穿透角质层。Niu等^[9]的研究表明脂质体中加入胆酸盐可增加脂质体的柔性，更有利于纳米粒穿透生物膜。因此，本研究以BA为模型药物，处方中加入去氧胆酸钠（sodium deoxycholate，SDC）制成一种SDC修饰醇质体，并通过正交设计优化得到SDC修饰醇质体处方，再进行了BA-SDC修饰醇质体与BA脂质体及普通醇质体的体外经皮渗透性比较，为BA经皮给药系统的研究及产品开发提供新思路。

BA（质量分数≥98%，西安小草植物科技有限责任公司）；大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司）；葡聚糖凝胶（Sephadex G-50，北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；SDC（上海研生生化试剂有限公司）；异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇和乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；HJ—3数显恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；JY92—2D超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JEM—2100透射电镜（日本电子公司）；RYJ—6B型Franz扩散池（上海黄海药检仪器厂，有效扩散面积2.8 cm²，接收池体积6.5 mL）；Zetasizer Nano—ZS90型马尔文激光散射粒径测定仪（英国马尔文公司）。

实验动物为昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自浙江省医学科学院，许可证号SCXK（浙）2008-0033。

采用乙醇注入法制备：称取BA 20 mg、SDC 20 mg和大豆卵磷脂360 mg，加入6 mL乙醇使之完全溶解。持续搅拌下，密闭环境中以缓缓细流注入14 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液，继续搅拌10 min，然后在冰水浴条件下探头超声（200 W，工作10 s，间歇5 s）30次，将得到的样品冷藏、备用，即得BA-SDC修饰醇质体。

BA脂质体及普通醇质体均采用乙醇注入法制备，称取BA 20 mg和大豆卵磷脂380 mg，分别加入处方量乙醇使之完全溶解。持续搅拌下，密闭环境中以缓缓细流注入适量的pH 7.4磷酸盐缓冲液，使总体积达到20 mL。注完后继续搅拌，脂质体需将乙醇挥尽，普通醇质体则搅拌10 min即可。然后在冰水浴条件下探头超声（200 W，工作10 s，间歇5 s）30次，将得到的样品冷藏、备用，即分别制得BA脂质体及普通醇质体。

色谱柱为Hedera ODS-2 C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为40 ℃；检测波长为207 nm；流动相为乙腈-3%醋酸溶液（70∶30）；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10 μL。

精密称取干燥至恒定质量的BA对照品适量至100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为126.00 μg/mL BA储备液。分别精密量取储备液2、5、10、20、50 mL至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.3.1”色谱条件进样，记录峰面积。以BA质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程Y＝67.832 X＋8.952 7（n＝3），r＝0.999 6，线性范围为2.52～63.00 μg/mL。日间精密度和日内精密度的RSD值分别为1.79%和1.30%，低、中、高质量浓度（30.24、37.80、45.36 μg/mL）样品溶液回收率平均分别为100.9%、99.1%、102.3%，RSD分别为1.87%、1.92%、1.75%。

采用葡聚糖凝胶柱分离法^[11]测定包封率。取制备所得醇质体或脂质体混悬液0.5 mL，从已制备好的Sephadex G-50微柱凝胶顶端加入，转速为3 000 r/min条件下离心6 min，用1 mL水洗脱2次，合并滤液，用甲醇定容至50 mL，过0.22 μm微孔滤膜滤过，HPLC检测，计算得到包封药物的量（W_包）。取醇质体或脂质体混悬液0.5 mL，不经微柱离心，直接用甲醇稀释至相同倍数，用0.22 μm微孔滤膜滤过，HPLC检测，计算得醇（脂）质体中药物的总质量（W_总），计算包封率（包封率＝W_包 / W_总），结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 包封率、粒径及多分散指数测定结果 (±s，n=3) Table 1 Determination of polydispersity index of EE and particle size (±s，n=3) 样品 平均粒径 / nm 多分散指数 包封率 / % BA脂质体 182.4±7.9 0.267±0.014 83.6±2.5 BA普通醇质体 157.5±6.7** 0.238±0.011 87.2±2.3 BA-SDC修饰 醇质体 105.2±5.8**ΔΔ 0.193±0.009 92.7±2.0** 与BA脂质体相比：**P＜0.01；与BA普通醇质体相比：ΔΔP＜0.01 **P＜0.01 vs BA liposomes; ΔΔP＜0.01 vs BA ethosomes

表 1 包封率、粒径及多分散指数测定结果 (±s，n=3) Table 1 Determination of polydispersity index of EE and particle size (±s，n=3)

取与醇质体质量浓度相同的BA溶液0.5 mL，按上述方法过Sephadex G-50微柱凝胶，收集滤液，用甲醇定容至50 mL，过0.22 μm微孔滤膜滤过，HPLC检测，记录峰面积为A_后。取BA溶液0.5 mL，不经微柱离心，直接用甲醇稀释至相同倍数，用0.22 μm微孔滤膜滤过，HPLC检测，记录峰面积为A_前，计算微柱对游离BA的吸附率［(A_前－A_后) / A_前］，结果为99.6%，表明微柱对游离BA的吸附性能良好。最终测得BA脂质体、普通醇质体及SDC修饰醇质体的包封率平均值分别为为83.6%、87.2%和92.7%。SDC修饰醇质体与脂质体、普通醇质体比较，包封率均显著增加（P＜0.01）。

取BA脂质体或醇质体适量，采用马尔文激光散射粒径测定仪测定其平均粒径及多分散指数，结果见表 1。BA脂质体、普通醇质体和SDC修饰醇质体的平均粒径分别为182.4、157.5、105.2 nm。BA-SDC修饰醇质体与脂质体相比，其平均粒径显著性减小（P＜0.01），说明醇质体处方中加入SDC，制得的粒径为最小，且包封率提高。

通过对磷酸盐缓冲液pH值（X₁）、大豆卵磷脂和BA的质量比（X₂）、BA和SDC的质量比（X₃）、乙醇体积分数（X₄）、搅拌时间（X₅）5个单因素进行筛选，分别考察其对醇质体包封率的影响，结果见表 2。结果可知磷酸盐缓冲液pH值和搅拌时间对包封率的影响较小，同时确定磷酸盐缓冲液pH值为7.4，搅拌时间为10 min。利用正交试验设计优化对包封率影响较大的其余3个因素。

表 2(Table 2)

表 2 不同因素对包封率影响的试验结果 Table 2 Effects of different factors on EE 处方 X1 X2 X3 X4 / % X5 / min 包封率 / % 1 6.8 18∶1 1∶1 30 5 87.1 2 7.4 18∶1 1∶1 30 5 90.4 3 7.6 18∶1 1∶1 30 5 88.8 4 7.4 18∶1 1∶1 30 10 93.2 5 7.4 18∶1 1∶1 30 15 92.0 6 7.4 20∶1 1∶1 30 10 88.6 7 7.4 15∶1 1∶1 30 10 71.1 8 7.4 18∶1 1∶2 30 10 77.6 9 7.4 18∶1 2∶1 30 10 93.3 10 7.4 18∶1 1∶2 35 10 81.2 11 7.4 18∶1 1∶2 40 10 88.9

表 2 不同因素对包封率影响的试验结果 Table 2 Effects of different factors on EE

经过单因素考察，选择对SDC修饰醇质体制备影响较大因素：大豆卵磷脂和BA的质量比（A）、BA和SDC的质量比（B）、乙醇体积分数（C）为优化指标，包封率为考察指标，各因素取3水平，采用L₉(3⁴) 正交表进行试验，对醇质体处方进行优化。因素水平及实验结果见表 3，方差分析结果见表 4。

表 3(Table 3)

表 3 L9(34) 正交试验设计与结果 Table 3 Design and results of L9(34) orthogonal test 序号 A B C / % D 包封率 / % 1 20∶1 (1) 1∶2 (1) 30 (1) (1) 65.2 2 20∶1 (1) 1∶1 (2) 35 (2) (2) 92.5 3 20∶1 (1) 2∶1 (3) 40 (3) (3) 81.4 4 18∶1 (2) 1∶2 (1) 35 (2) (3) 81.9 5 18∶1 (2) 1∶1 (2) 40 (3) (1) 89.6 6 18∶1 (2) 2∶1 (3) 30 (1) (2) 93.7 7 15∶1 (3) 1∶2 (1) 40 (3) (2) 40.2 8 15∶1 (3) 1∶1 (2) 30 (1) (3) 70.6 9 15∶1 (3) 2∶1 (3) 35 (2) (1) 73.5 K1 239.1 187.3 229.5 228.3 K2 265.2 252.7 247.9 226.4 K3 184.3 248.6 211.2 233.9 R 80.9 65.4 36.7 7.5

表 3 L9(34) 正交试验设计与结果 Table 3 Design and results of L9(34) orthogonal test

表 4(Table 4)

表 4 方差分析 Table 4 Analysis of variance 方差来源 离差平方和 自由度 F值 显著性 A 1 136.562 2 112.131 P＜0.01 B 894.629 2 88.263 P＜0.05 C 224.482 2 22.147 P＜0.05 D（误差） 10.136 2 F0.05(2,2)＝19.00 F0.01(2,2)＝99.00

表 4 方差分析 Table 4 Analysis of variance

根据表 4方差分析结果可知，各因素对醇质体包封率影响大小依次为A＞B＞C，其中因素A具有极显著影响（P＜0.01），因素B、C具有显著影响（P＜0.05）；初步确定最佳处方工艺组合为A₂B₂C₂，即大豆卵磷脂与BA的质量比为18∶1，BA与SDC质量比1∶1，乙醇体积分数为35%。按优化后处方制备3批BA-SDC修饰醇质体，测定其平均粒径和包封率，结果见表 5。优化处方后制备的BA-SDC修饰醇质体平均粒径为（102.3±3.6）nm，包封率为（93.8±1.6）%。结果表明，该处方与工艺稳定性可控，重现性好。

表 5(Table 5)

表 5 验证结果 Table 5 Results of verification 批号 平均粒径 / nm 多分散指数 包封率 / % 1 105.6 0.195 94.5 2 102.9 0.186 91.9 3 98.5 0.189 94.9 平均值 102.3 0.190 93.8

表 5 验证结果 Table 5 Results of verification

吸取优化处方后制备的醇质体混悬液少许滴于有支持膜的铜网上，滤纸吸取铜网边缘多余液体，待稍干后，以透射电镜观察其形态，结果见图 1。由图 1可知，BA-SDC修饰醇质体外观呈类球形，粒子大小比较均一。

图 1

Fig. 1

图 1 BA-SDC修饰醇质体电镜照片 Fig. 1 Electron micrograph of ethosomes modified by BA-SDC

取体质量合格的健康昆明种小鼠，颈椎脱臼法处死，腹部剪毛。剪下腹部皮肤，小心去除皮肤上的短毛、皮下组织和筋膜，放大镜观察确保皮肤角质层的完整性。用生理盐水漂洗干净后备用。将皮肤夹于双室扩散池中，角质层面向供给池，真皮层面向接收液；分别取1 mL BA-SDC修饰醇质体、BA普通醇质体、BA脂质体以及BA 10%异丙醇饱和溶液（含药物BA量均为1 mg）加入供给池，接触皮肤角质层。以10%异丙醇水溶液作为接收介质，37 ℃水浴保温，并以400 r/min速度搅拌；分别于1、2、3、4、6、8、10、12 h定时取样1 mL（同时补充37 ℃保温的等量空白接收液）。接收液经蒸干，用甲醇定容至1 mL经0.22 μm微孔滤膜滤过，按“2.3.1”项色谱条件进样检测并计算质量浓度，计算累计渗透量（Q_n），结果见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 BA在不同载体中的累积渗透量曲线 (n= 3) Fig. 2 Accumulated permeation amount curves of BA from different carriers (n = 3)

ρ_n为不同取样点时的接收液中BA质量浓度（μg/mL），ρ_i为各取样点时取样液中BA质量浓度（μg/mL），V为接收池体积（mL），V_i为每次取样体积（mL），A为有效扩散面积（cm²）

结果显示，BA在不同载体中12 h累计渗透量由大到小的顺序依次为BA-SDC修饰醇质体＞BA普通醇质体＞BA脂质体＞BA 10%异丙醇饱和溶液。其中BA-SDC修饰醇质体12 h的累积渗透量为（99.62±9.44）μg/cm²，分别是BA普通醇质体、BA脂质体和BA 10%异丙醇饱和溶液的1.67、3.85和8.33倍，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。

取适量BA-SDC修饰醇质体密封于锥形瓶中，分别置于4、25 ℃条件下保存，分别于0、1、2、3个月测定样品的包封率。结果4 ℃时的包封率分别为91.9%、91.2%、90.6%、90.1%，25 ℃时的包封率分别为91.9%、90.7%、90.3%、89.6%。可知BA-SDC修饰醇质体稳定性良好。

本研究结果表明，与脂质体和普通醇质体相比，BA-SDC修饰醇质体具有较小的粒径范围和较高的包封率。进一步进行正交试验优化SDC修饰醇质体的处方，发现乙醇体积分数过低将不利于对药物的包封，乙醇体积分数增加，包封率也随之提高。但当乙醇体积分数超过35%时，包封率反而降低，可能有部分磷脂溶解。

体外透皮实验中，由于BA不溶于水，必须选择合适的接收液才能满足实验要求的漏槽状态，考虑到介质对皮肤的影响以及能更好的模拟药物在体内的渗透条件，通过预试验选择10%异丙醇溶液作为接受介质。

醇质体与脂质体相比，由于乙醇的加入使得双分子层膜具有良好的柔韧性和流动性，在经皮传递过程中易于变形，因而更容易穿过皮肤屏障进入皮肤深部甚至体循环，促进药物的经皮转运^[13]。本研究发现BA在醇质体系统12 h累计渗透量高于其脂质体，能显著增强药物透皮效率，这与醇本身促透作用有关，也与醇的加入形成的醇质体的粒径更小，膜流动性更强等因素。且BA在SDC修饰醇质体系统中累积渗透量、渗透速率明显高于普通醇质体，原因可能有以下2个方面：由于SDC的存在使得所制备的醇质体粒径较小，而且均匀；SDC为透皮吸收促进剂，在柔性脂质体中应用，可以增加脂质体的变形能力，在醇质体中应用，也可增强醇质体的变性能力，有利于提高BA的透皮速率。