辛夷Magnoliae Flos为木兰科（Magnoliaceae）木兰属Magnolia L. 植物望春花Magnolia biondii Pamp.、玉兰Magnolia denudata Desr. 或武当玉兰Magnolia sprengeri Pamp. 的干燥花蕾，有祛风发散、通鼻窍之功效^[1]。现代药理研究表明，辛夷挥发油（volatile oil of MagnoliaeFlos，VOMF）具有收敛和改善微循环作用，以及对过敏性慢反应物、组胺和乙酰胆碱引起的收缩均有对抗作用^[2]。但VOMF中所含的a-松油醇为毒性成分，对黏膜和纤毛有较大的剌激性^[3]。本课题组前期采用硅胶柱色谱法对VOMF进行分离处理，剔除其中的a-松油醇^[3]，得到无a-松油醇VOMF。本实验所用制剂用药均为无a-松油醇VOMF。

近年来，已研究开发了许多治疗变异性鼻炎的VOMF新型经鼻给药剂型，如β-环糊精包合物、纳米脂质体等^[4,5,6]，但查阅文献，尚未见其醇质体制剂的相关研究报道，而醇质体作为包封药物的一种新型载体，与普通脂质体相比其粒径较小、结构稳定、包封率高、变形性高、透过量多，有更好的柔性，易于携带药物穿过黏膜，是良好的鼻腔给药载体^[7]。因此，本实验先将剔除a-松油醇的VOMF制备成醇质体，再结合传统鼻用喷雾剂药物定量准确、鼻腔内分布均匀、吸收快、使用方便等特点^[8]，将其制备成醇质体喷雾剂，并对其质量进行考察，为进一步研究相关制剂提供参考，具有重要的意义。

RE—52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；GCMS-QP2010气-质联用色谱仪，日本岛津；78—1型磁力加热搅拌器，江苏省金坛市正基仪器有限公司；FJ—200高速分散匀质机，上海标本模型仪器厂；LG16—W高速离心机，北京医用离心机厂；Zeta sizer ZEN 3600型激光粒度仪，英国Malvern公司；JEM—2000EX透射电子显微镜，日本电子公司；喷雾瓶，西安化玻仪器有限公司。

β-蒎烯（分析对照品，质量分数98%，阿拉丁试剂有限公司）；VOMF（水蒸气蒸馏法提取，辛夷药材购自西安市万寿路药材市场，经西北大学胡正海教授鉴定为望春花Magnolia biondii Pamp. 的干燥花蕾，出油率为2.1%）；大豆卵磷脂，天津市博迪化工有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），陕西森佛生物科技有限公司；盐酸麻黄碱（批号050914-1），沈阳第一制药厂；去氧胆酸钠（批号060814，北京华美生物工程公司）；无水乙醇（色谱醇）；0.22 μm微孔滤膜，上海新亚药业有限公司；其余试剂均为分析纯。

中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor，普通级，体质量50～60 g，雌雄不限，由西安交通大学实验动物中心提供，许可证号：医动字第08-016。

采用注入法^[9]制备无a-松油醇VOMF醇质体，将处方量的大豆卵磷脂、挥发油、胆固醇溶于一定量的无水乙醇中，置于600 r/min磁力搅拌器上，维持乳化温度30 ℃，在密闭容器中用注射器以细流状缓慢注入定量的蒸馏水，注射完后继续搅拌30 min，再高速匀质（10 000 r/min）10 min，用0.22 μm微孔滤膜滤过即得，4 ℃保存。取所制得的醇质体分装于10 mL鼻腔给药喷雾瓶中，即得。

按“2.1”项下方法，不加挥发油，制备空白醇质体。

用GC法测定VOMF醇质体的包封率和载药量^[7]。

选取β-蒎烯作为内参物，利用气相色谱仪测定纯β-蒎烯溶液的GC图谱。GC的条件为炉温150 ℃；检测器温度200 ℃；进样器温度240 ℃。精密称取β-蒎烯对照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取1 μL，进行GC检测，以色谱峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝15 909 679 X＋4 709，r＝0.999 8，线性范围为20～160 μg/mL。

精密吸取VOMF醇质体0.5 mL于10 mL量瓶中，加入适量Triton X-100超声后定容至刻度，即得供试品溶液。

取“2.3.3”项下质量浓度为2.5 mg/mL的供试品溶液，按“2.3.2”中的色谱条件测定，重复进样6次，以β-蒎烯的峰面积计算，其RSD值为1.57%，表明仪器精密度良好。

取“2.3.3”项下质量浓度为2.5 mg/mL的供试品溶液，照上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样，其RSD值为1.36%，结果表明溶液至少在12 h内稳定。

取同批样品6份，分别制备供试品溶液并按色谱条件进行测定，记录峰面积，β-蒎烯峰面积的RSD值为1.50%，说明该方法重复性良好。

取空白醇质体溶液，分别加入不同量的β-蒎烯对照品溶液于量瓶中，Triton X-100破乳并稀释定容成20、80、160 μg/mL的溶液，每一质量浓度测定3次。测得平均回收率分别为99.02%、98.24%、98.56%，RSD值分别为0.96%、1.34%、1.26%，符合要求。

制备一组相同的VOMF醇质体，把醇质体平均分成2份，其中1份通过高速离心和滤膜滤过法分离，测定溶液中所含的VOMF中β-蒎烯的量（W₁）。另1份通过加入一定量的Triton X-100使醇质体充分破坏，释放出包封的VOMF，然后测定总的VOMF中β-蒎烯的量（W₂）；以W₃表示醇质体的总质量，再根据下式计算包封率和载药量。

包封率＝(W₂－W₁) / W₂

载药量＝(W₂－W₁) / W₃

根据预试验结果，以磷脂用量（A）、乙醇用量（B）和胆固醇用量（C）为考察因素，各取3个水平进行L₉(3⁴) 正交设计，以包封率和载药量的综合评分为考察指标。评分标准为满分100分，载药量和包封率各占50%；包封率得分以各试验号包封率除最高包封率，再乘100得到，载药量得分按同法计算，综合评分将包封率和载药量2项得分相加即得。采用直观分析方法筛选醇质体的最佳处方。试验设计及结果见表 1，方差分析见表 2。

表 1(Table 1)

表 1 L9(34)正交试验设计与结果 Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test 试验号 A / % B / % C / % D (空白) 包封率 / % 载药量 / % 综合评分 1 1.5 (1) 30 (1) 0.10 (1) (1) 52.45 2.61 85.44 2 1.5 (1) 33 (2) 0.15 (2) (2) 53.19 2.79 88.88 3 1.5 (1) 36 (3) 0.20 (3) (3) 58.55 2.96 96.11 4 2.5 (2) 30 (1) 0.15 (2) (3) 43.75 2.75 80.20 5 2.5 (2) 33 (2) 0.20 (3) (1) 44.45 2.98 84.38 6 2.5 (2) 36 (3) 0.10 (1) (2) 46.93 3.21 90.08 7 3.5 (3) 30 (1) 0.20 (3) (2) 34.07 2.74 71.77 8 3.5 (3) 33 (2) 0.10 (1) (3) 39.34 2.65 74.87 9 3.5 (3) 36 (3) 0.15 (2) (1) 42.96 3.04 84.04 K1 270.43 237.41 250.39 253.86 K2 254.66 248.13 253.12 250.73 K3 230.68 270.23 252.26 251.18 R 39.75 32.82 2.73 3.13

表 1 L9(34)正交试验设计与结果 Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test

表 2(Table 2)

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance 误差来源 偏差平方和 自由度 F值 显著性 A 267.088 2 139.910 P＜0.01 B 186.720 2 97.810 P＜0.05 C 1.299 2 0.680 D (误差) 1.909 2 F0.05(2,2)＝19.00 F0.01(2,2)＝99.00

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance

由试验结果可知，各考察因素对该醇质体的包封率和载药量双项综合指标中因素A对综合指标的影响最大，具有极显著性；因素B的影响次之，也具有显著性；因素C的影响不具有显著性差异。因此，确定最优处方为A₁B₃C₂，即大豆磷脂用量为1.5%，乙醇用量为36%，胆固醇用量为0.15%，按此处方制得的该醇质体载药量为2.96%。

按正交试验设计得到的优化处方，制备3批无a-松油醇VOMF醇质体，按“2.3.8”项下方法测得包封率分别为58.45%、57.72%、59.48%，平均包封率为（58.55±1.88）%，平均载药量为（2.96±0.04）%。故所制得该醇质体包封率和载药量稳定，所确定的优化工艺合理可行，稳定可靠，具有可操作性和重现性。

将制备得到的VOMF醇质体样品稀释至35倍，吸取混悬液少许滴于有支持膜的铜网上，稍干后用磷钼酸负染色法染色，滤纸吸铜网边缘多余液体后置于透射电镜下观察样品的大小及形态。由透射电镜（TEM）照片（图 1）可见，VOMF醇质体为近球状小囊泡，外形圆整光滑，形态分布均一。

图 1

Fig. 1

图 1 VOMF醇质体电镜照片 Fig. 1 Transmission electron microscope of VOMF ethosome

取制备得到的适量醇质体，滴入盛样器，采用电位测定仪测定醇质体的Zeta电位（图 2），结果显示Zeta电位为（-55.9±2.1）mV；采用激光粒度仪测定醇质体的平均粒径为（186.7±1.9）nm，粒径分布如图 3-A所示。

图 2

Fig. 2

图 2 醇质体Zeta电位分布图 Fig. 2 Zeta potentialdistribution of ethosome

图 3

Fig. 3

图 3 喷雾前 (A) 和喷雾后 (B) 粒径分布图 Fig. 3 Particle size distribution before (A) and after (B) spraying

（1）pH值测定：取制得的醇质体用精密pH计测定。

（2）过氧化值的测定：采用丙二醛检测法，通过测定磷脂氧化产物丙二醛的量及其与放置时间的关系，间接地考察醇质体膜材的氧化程度，利用丙二醛在酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红色产物，在534 nm处有特异吸收的特点，测定其吸光度（A）值可得出丙二醛的量。具体方法：称取三氯乙酸（TCA）30 g，TBA 0.75 g，加0.25 mol/L盐酸200 mL，温热溶解，滤过后得到TCA-TBA-HCl溶液。精密量取醇质体混悬液0.8 mL，混匀，100 ℃水浴加热30 min，放冷，加入TCA-TBA-HCl溶解，转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，混匀后以4 000 r/min的速度离心5 min，以TCA-TBA-HCl试液为空白，测定其534 nm处A值，即为过氧化值。

将4℃保存的醇质体分别在0、1、2、4、6个月定时取样，检测药物包封率、pH值、过氧化值，结果见表 3。由表 3可知，随着放置时间的延长，其包封率及pH值有下降的趋势，过氧化值则有所增加。但各项指标变化不大，说明该醇质体在4 ℃条件下稳定性良好。

表 3(Table 3)

表 3 醇质体的稳定性 (n＝3) Table 3 Stability of ethosomes (n＝3) 时间 包封率 / % pH值 过氧化值 0个月 58.55±1.88 6.67 0.243 1个月 58.34±2.45 6.65 0.244 2个月 58.02±3.97 6.63 0.246 4个月 57.79±1.06 6.58 0.249 6个月 57.70±3.62 6.55 0.252

表 3 醇质体的稳定性 (n＝3) Table 3 Stability of ethosomes (n＝3)

用激光散射法测定VOMF醇质体喷雾前、后的粒径及粒度分布情况，其结果见图 3。醇质体粒径较小且均匀，喷雾后粒径分布范围明显变窄，160 nm左右的粒子所占的比例明显增加，平均粒径由原来的186.7 nm减少到172.8 nm，多分散指数也由原来的0.207降低到0.195。由结果可知，该醇质体喷雾后粒子更加细小而均匀。

取“2.4.2”项下制备的3批醇质体用同一喷雾瓶进行雾化，收集喷雾液，测定醇质体喷雾后的平均包封率为（58.59±0.63）%，由结果可知经喷雾器雾化后其醇质体包封率基本不变。

中华大蟾蜍35只，随机分为7组，每组5只。以生理盐水为空白对照，选用公认无纤毛毒性的1%盐酸麻黄碱作为阴性对照品，有严重纤毛毒性的1%去氧胆酸钠作为阳性对照品^[10,11]。以纤毛运动持续时间（persistent vibration duration，PVD）和纤毛持续运动率（percentage of persistent vibration，PPV）作为指标，综合评价VOMF原油、无a-松油醇VOMF及其醇质体喷雾剂和空白醇质体的鼻黏膜纤毛毒性。将蟾蜍仰卧固定在蛙板上，以止血钳牵拉使其口腔张开，于上腭黏膜处分别滴加上述7组溶液各0.5 mL，使完全浸没上腭，接触0.5 h后用生理盐水冲洗干净，剪取上颚黏膜3 mm×3 mm，用25 ℃生理盐水冲洗干净药物后，小心分离上腭黏膜，随即用生理盐水洗净杂物。然后使纤毛面向上平铺于载玻片上，于黏膜表面滴加生理盐水，盖上盖玻片，光学显微镜下观察纤毛运动情况。将黏膜置于预先用少量蒸馏水饱和的层析缸中，密闭，环境温度25 ℃，此后每隔适当时间取出上颚标本于光学显微镜下观察，记录从给药开始至纤毛运动停止所持续的时间，即PVD。以各给药组的PVD除以生理盐水组的PVD即得PPV，PPV越高，则表示药物对纤毛的毒性越小。由表 4可知，与生理盐水组比较，VOMF原油组的PVD为432 min，具有显著性差异；与VOMF原油组比较，无a-松油醇VOMF组的PVD增加了185 min，PPV也由原来的57.4%增加到82.0%；将无a-松油醇VOMF制备成醇质体喷雾剂后其PPV达到92.2%，与空白醇质体比较无显著性差异。这些结果表明，空白醇质体鼻腔给药无纤毛毒性，VOMF原油组具有显著的纤毛毒性，而无a-松油醇VOMF醇质体喷雾剂组从给药开始至纤毛运动停止所持续的时间明显延长。

表 4(Table 4)

表 4 各组纤毛PVD和PPV (±s，n=5) Table 4 PVDand PPV in each group (±s，n=5) 组别 PVD / min PPV / % 生理盐水 752.4±58.3 100.0 1%盐酸麻黄碱 741.3±47.2 98.6 1%去氧胆酸钠 8.2±3.4** 1.1 VOMF原油 432.6±62.3 57.4 无a-松油醇VOMF 617.2±42.5 82.0 醇质体喷雾剂 693.5±51.7△△ 92.2 空白醇质体 711.6±41.5 94.6 与生理盐水组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与原油组比较：△△P＜0.01 *P< 0.05 **P < 0.01 vs saline group; △△P < 0.01 vs VOMF group

表 4 各组纤毛PVD和PPV (±s，n=5) Table 4 PVDand PPV in each group (±s，n=5)

醇质体的平均粒径与药物包封率是评价药物传递系统的重要参数，实验发现乙醇和磷脂量可直接影响醇质体的包封率，且乙醇量过低不利于醇质体对药物的包封，胆固醇在制备过程中可增强醇质体的稳定性，这与相关研究的结论基本一致^[12]。本实验制得的醇质体通过电镜观察，其形状规则近似球形，粒径理想。Zeta电位为（-55.9±2.1）mV，表明醇质体粒子表面带负电荷，这在一定程度上阻止了醇质体粒子的聚集，保证了混悬液的稳定性，显示处方工艺可行，但由于是首次将VOMF中的毒性成分a-松油醇剔除后制备成醇质体，其包封率和载药量相对较低，因此，其制备工艺有待进一步提高。

纤毛毒性试验显示，VOMF原油直接鼻腔给药后具有显著的纤毛毒性，而经分离处理后的挥发油成分与VOMF原油相比，纤毛毒性明显下降，纤毛持续运动百分率达到82.0%，这可能与剔除挥发油中的毒性成分密切相关。本实验将其制备成醇质体后基本无纤毛毒性，也表明醇质体可以安全用于鼻腔给药，这与相关研究结论基本一致^[13]。