淋巴细胞增殖实验是检测淋巴细胞活性的重要手段，是免疫评价的常用实验，常用方法有MTT法和近年来的CCK-8法。MTT法具经济、安全、简便等特点，外源性MTT通过活细胞线粒体脱氢酶转化为不溶于水的甲臜颗粒，应用DMSO溶解，但过程中可能有溶解不完全、吸出上清液时带走部分细胞等问题，导致出现较大误差，重复性差。在CCK-8（cell counting kit-8）法中，四唑盐-WST-8通过活细胞线粒体脱氢酶转化为高度水溶性的黄色结晶，可直接进行比色，吸光度与活细胞数量呈正比，对细胞毒性小，较MTT法简便，避免了MTT法溶解过程中的缺点，近年来在检测细胞活性中得到广泛应用，但检测淋巴细胞增殖的条件还未完全成熟，本课题组通过交叉设计对应用CCK-8法检测BALB/c小鼠脾淋巴细胞增殖的条件进行了探讨。

雄性SPF级BALB/c小鼠，8周龄，体质量18~22 g，由中山大学（大学城）实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK（粤）2011-0029。

CCK-8试剂盒，购自广州晶欣生物科技有限公司；刀豆蛋白（ConA）和脂多糖（LPS），购自美国Sigma公司。

Scientific HERA Cell 150i CO₂培养箱、Multiskan Ascent多功能酶标仪（美国Thermo公司）。

脱颈椎处死小鼠，无菌取其脾脏，常规制备脾细胞悬液^[1]。制备过程中，脾脏剪碎，用一次性注射器活塞在筛网（200目一次性）上轻轻研磨或轻压制备脾细胞。

用RPMI 1640不完全培养基配制20、50、100 μg/mL ConA和100、200、500 μg/mL LPS溶液。

按“2.1”项方法轻轻研磨制备脾细胞，10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培养基适应培养24 h后，用含10% FBS的培养基调整细胞数为适宜浓度（1×10⁶、2×10⁶、5×10⁶、1×10⁷/mL），加入96孔细胞培养板，每孔90 μL。加入10 μL ConA溶液使其终浓度为2、5、10 μg/mL或10 μL LPS溶液使其终浓度为10、20、50 μg/mL，设空白对照（空白培养基，无细胞）和细胞对照孔（无ConA或LPS刺激），各样本设置3个复孔。孵育48 h，孵育结束前4 h，每孔加入10 μL CCK-8，继续培养4 h。

450 nm波长下，酶标仪检测吸光度（A）值。计算各条件下脾细胞的增殖率。

按“2.1”项方法，采用轻轻研磨和轻压两种方法制备脾细胞，部分细胞不经适应培养直接种板，另一部分细胞适应培养24 h后种板，用含10%、15%、20% FBS的培养基分别调整细胞数为适宜浓度（2×10⁶和5×10⁶/mL），加入96孔细胞培养板，每孔90 μL。

加入10 μL ConA溶液使其终浓度为5 μg/mL或10 μL LPS溶液使其终浓度为20 μg/mL，设空白对照和细胞对照孔，继续培养48或72 h，CCK-8法检测细胞增殖率，方法同“2.3”项。

在轻磨制备细胞、细胞适应培养24 h、含10% FBS的培养基中孵育48 h的条件下，不同细胞浓度、不同分裂素浓度对BALB/c小鼠脾细胞增殖率的影响如表 1所示，最佳细胞浓度为2×10⁶~5×10⁶/mL。其中5×10⁶/mL细胞浓度的A值在0.35~0.90，属CCK-8细胞反应的线性范围内，而2×10⁶/mL细胞浓度A值在0.18~0.32，A值偏低，趋向于选择5×10⁶/mL细胞浓度。ConA在2、5、10 μg/mL浓度，LPS在10、20、50 μg/mL浓度，细胞增殖率未明显差异。

表 1(Table 1)

表 1 不同分裂素浓度、细胞浓度对小鼠脾细胞增殖的影响(x±s, n=3) Table 1 Effects of stimulating agent with various concentration and lymphocytic density on proliferation rate in mouse spleen lymphocyte (x±s, n=3) 组别 浓度/（μg·mL-1） 细胞浓度10×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度1×106 mL-1 A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% 空白对照 - 0.138±0.030 - 0.138±0.030 - 0.138±0.030 - 0.138±0.030 - 细胞对照 - 0.807±0.028 - 0.402±0.023 - 0.191±0.002 - 0.165±0.007 - ConA 2 1.007±0.004 130 0.770±0.065 240 0.223±0.011 161 0.169±0.008 113 5 1.107±0.021 145 0.849±0.033 270 0.275±0.007 259 0.170±0.004 117 10 1.040±0.013 135 0.811±0.047 255 0.335±0.010 372 0.189±0.014 186 组别 浓度/（μg·mL-1） 细胞浓度10×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度1×106 mL-1 A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% 空白对照 - 0.137±0.002 - 0.137±0.002 - 0.137±0.002 - 0.137±0.002 - 细胞对照 - 0.807±0.008 - 0.324±0.003 - 0.189±0.000 - 0.167±0.001 - LPS 10 0.593±0.038 68 0.664±0.043 281 0.262±0.006 239 0.175±0.010 125 20 0.600±0.014 69 0.706±0.036 304 0.274±0.011 262 0.174±0.002 124 50 0.645±0.095 76 0.758±0.055 331 0.257±0.016 230 0.175±0.016 127

表 1 不同分裂素浓度、细胞浓度对小鼠脾细胞增殖的影响(x±s, n=3) Table 1 Effects of stimulating agent with various concentration and lymphocytic density on proliferation rate in mouse spleen lymphocyte (x±s, n=3)

如表 2所示，在ConA浓度为5 μg/mL或LPS浓度为20 μg/mL、直接种板刺激的条件下，轻压的脾脏制备方法明显优于轻磨，采用轻压方法制备的细胞，经ConA或LPS刺激后，细胞增殖明显，应与轻压对细胞损伤较小有关；且5×10⁶/mL的细胞浓度明显优于2×10⁶/mL，进一步证实了5×10⁶/mL细胞浓度为最合适的浓度；在其他条件保持一致的情况下，48、72 h的脾细胞增殖率无明显差异；FBS在培养基中的浓度（10%、15%、20%）对脾细胞增殖率的影响不明显。

表 2(Table 2)

表 2 细胞制备后直接种板刺激，不同孵育时间、细胞制备手法、血清浓度对小鼠脾细胞增殖的影响(x±s, n=3) Table 2 Stimulating immediately after preparing cell, effect on proliferation rate in mouse spleen lymphocyte treated with various stimulating time, cell preparation method and concentration of FBS (x±s, n=3) 培养基 组别 孵育48 h轻压 孵育48 h轻磨 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% 20%FBS 空白对照 0.132±0.002 - 0.132±0.002 - 0.131±0.003 - 0.131±0.003 - 细胞对照 0.209±0.004 - 0.154±0.003 - 0.228±0.006 - 0.166±0.001 - ConA 0.593±0.062 599 0.213±0.001 363 0.436±0.024 315 0.197±0.011 192 LPS 0.591±0.017 597 0.214±0.007 367 0.233±0.001 105 0.176±0.007 131 15%FBS 细胞对照 0.209±0.003 - 0.160±0.003 - 0.581±0.023 - 0.238±0.004 - ConA 0.806±0.021 872 0.249±0.008 408 0.431±0.011 67 0.219±0.005 82 LPS 0.737±0.044 783 0.254±0.006 427 0.595±0.023 103 0.231±0.001 94 10%FBS 细胞对照 0.210±0.003 - 0.167±0.015 - 0.221±0.000 - 0.170±0.001 - ConA 0.768±0.039 808 0.235±0.002 291 0.383±0.017 280 0.196±0.008 167 LPS 0.694±0.010 715 0.247±0.021 324 0.473±0.004 380 0.210±0.000 203 培养基 组别 孵育72 h轻压 孵育72 h轻磨 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% 20%FBS 空白对照 0.142±0.010 - 0.142±0.010 - 0.130±0.002 - 0.130±0.002 - 对照 0.207±0.010 - 0.168±0.009 - 0.236±0.008 - 0.161±0.001 - ConA 0.458±0.037 484 0.213±0.008 271 0.339±0.007 197 0.180±0.001 160 LPS 0.596±0.027 696 0.225±0.016 318 0.407±0.026 261 0.175±0.004 146 15%FBS 细胞对照 0.216±0.003 - 0.198±0.012 - 0.208±0.002 - 0.163±0.001 - ConA 0.621±0.040 645 0.235±0.021 166 0.334±0.025 264 0.188±0.005 175 LPS 0.670±0.004 711 0.268±0.023 224 0.427±0.042 384 0.174±0.006 134 10%FBS 细胞对照 0.251±0.014 - 0.232±0.034 - 0.202±0.001 - 0.161±0.001 - ConA 0.666±0.038 480 0.262±0.034 133 0.260±0.003 182 0.174±0.001 145 LPS 0.771±0.006 576 0.314±0.045 190 0.318±0.003 264 0.169±0.001 127

表 2 细胞制备后直接种板刺激，不同孵育时间、细胞制备手法、血清浓度对小鼠脾细胞增殖的影响(x±s, n=3) Table 2 Stimulating immediately after preparing cell, effect on proliferation rate in mouse spleen lymphocyte treated with various stimulating time, cell preparation method and concentration of FBS (x±s, n=3)

表 3总体上进一步证实了表 2的结果，结合表 2和表 3发现，在相同条件下脾细胞制备后直接种板刺激的A值和细胞增殖率明显高于适应培养24 h后再种板刺激。

表 3(Table 3)

表 3 细胞适应培养24 h，不同孵育时间、细胞制备手法、血清浓度对小鼠脾细胞增殖的影响(x±s, n=3) Table 3 Cell culture for 24 h before stimulating, effects of various stimulating time, cell preparation methods, and concentration of FBS on proliferation rate in mouse spleen lymphocyte (x±s, n=3) 培养基 组别 孵育48 h轻压 孵育48 h轻磨 孵育72 h轻压 孵育72 h轻磨 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 细胞浓度5×106 mL-1 细胞浓度2×106 mL-1 A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% A值 增殖率/% 20%FBS 空白对照 0.143±0.012 - 0.143±0.012 - 0.131±0.002 - 0.131±0.002 - 0.129±0.003 - 0.129±0.003 - 0.152±0.007 - 0.152±0.007 - 细胞对照 0.212±0.007 - 0.181±0.013 - 0.259±0.002 - 0.157±0.009 - 0.195±0.004 - 0.149±0.005 - 0.331±0.003 - 0.184±0.008 - ConA 0.317±0.010 251 0.221±0.016 202 0.388±0.010 201 0.152±0.008 81 0.237±0.002 163 0.175±0.004 237 0.496±0.017 192 0.194±0.013 131 LPS 0.347±0.002 294 0.221±0.022 203 0.441±0.005 243 0.167±0.015 139 0.267±0.003 208 0.163±0.005 172 0.539±0.027 216 0.197±0.009 140 15%FBS 细胞对照 0.177±0.007 - 0.302±0.025 - 0.219±0.005 - 0.155±0.010 - 0.145±0.002 - 0.172±0.070 - 0.270±0.001 - 0.190±0.012 - ConA 0.220±0.014 226 0.773±0.043 396 0.321±0.013 215 0.159±0.018 117 0.165±0.004 226 0.524±0.050 920 0.341±0.023 160 0.189±0.007 97 LPS 0.198±0.007 162 0.613±0.052 296 0.321±0.012 216 0.163±0.006 134 0.186±0.010 357 0.495±0.022 853 0.321±0.045 144 0.184±0.008 84 10%FBS 细胞对照 0.200±0.018 - 0.315±0.057 - 0.213±0.001 - 0.159±0.004 - 0.177±0.005 - 0.263±0.001 - 0.264±0.005 - 0.199±0.006 - ConA 0.233±0.017 157 0.516±0.098 217 0.315±0.008 225 0.160±0.019 104 0.203±0.010 154 0.582±0.020 338 0.331±0.014 160 0.195±0.012 92 LPS 0.232±0.018 155 0.543±0.062 233 0.266±0.012 165 0.165±0.014 122 0.189±0.008 126 0.411±0.009 210 0.321±0.008 151 0.208±0.016 119

表 3 细胞适应培养24 h，不同孵育时间、细胞制备手法、血清浓度对小鼠脾细胞增殖的影响(x±s, n=3) Table 3 Cell culture for 24 h before stimulating, effects of various stimulating time, cell preparation methods, and concentration of FBS on proliferation rate in mouse spleen lymphocyte (x±s, n=3)

脾细胞增殖实验受多种条件的影响，如细胞制备方法、种板的细胞浓度、分裂素浓度、血清浓度、刺激时间等，可能与细胞制备后的活性、细胞密度过大抑制生长或培养基营养不足、分裂素本身毒性等因素相关。本研究结果发现，ConA和LPS刺激的Balb/C小鼠脾细胞增殖实验的最佳条件为：轻压制备脾细胞、脾细胞浓度为5×10⁶/mL、制备当天直接种板、ConA的刺激浓度为2~10 μg/mL，LPS的刺激浓度为10~50 μg/mL，刺激时间在48、72 h对脾细胞增殖率无明显影响，用48 h即可，培养基中10%、15%、20% FBS的浓度对脾细胞增殖率无明显影响。

小鼠脾细胞增殖的CCK-8法和文献上MTT法最优条件^[1-3]比较发现，分裂素浓度、培养基血清浓度、刺激时间一致，而MTT法的细胞浓度较低，为（1.5~2.0）×10⁶/mL，与本研究结果有一定的差异。