动物组织的病理学检查是毒理学试验结果评价的一个重要组成部分，随着石蜡切片、免疫组化等在病理检查中的普遍应用及GLP的实施，对动物脏器组织切片的制作要求越来越严格，不同的固定液和固定时间都会影响制片的质量^[1]，从而影响病理学工作者对试验结果的判断分析，造成不必要的人为偏差。所以选择合适的固定液和固定时间可以保证动物组织结构的完整性，便于充分地进行病理诊断。睾丸是药物毒性研究中的雄性性器官之一，具有产生精子和分泌雄性激素等重要功能。睾丸由实质和间质构成^[3]，其中实质占大部分，主要为卷曲的曲细精管，曲细精管上皮又包含生精细胞和支持细胞。由于常规的固定方法易造成曲细精管结构缺失，不利于病理学诊断，故有必要选择合适的固定液和固定时间对睾丸组织进行固定，确保组织结构的完整性。为此，作者采用3种不同类型的固定液及不同的固定时间对SD大鼠睾丸组织进行固定后制片，并通过光学显微镜镜下观察，以此综合确定合适的固定液和固定时间。

德国TP1020全自动组织脱水机，德国EG1160石蜡包埋机，德国RM2155电动轮转切片机，LEICA DM5000B普通光学显微镜，甲醛（批号20120501，天津永大化学试剂有限公司），95%乙醇（批号20130810，天津大茂化学试剂厂），冰乙酸（批号20101008，天津百世化工有限公司），磷酸二氢钠（批号20130418，天津市大茂化学试剂厂），磷酸氢二钠（批号20130418，国药集团化学试剂有限公司）。

雄性SD大鼠12只，每只动物取睾丸组织，共24例标本。每例标本经不同固定液和固定时间处理后取材。

10%的福尔马林固定液、FAA固定液、30% Davidson固定液分别固定24 h和48 h后更换到10%中性福尔马林溶液中。

常规脱水、浸蜡、包埋、切片（厚度3 μm）和HE染色后，光学显微镜下观察。

镜下结果显示：①固定24 h后10%福尔马林组睾丸间质可见较大空隙，精子生发层排列整齐，细胞分级较明显，部分生精小管可见裂隙（图 1-A，图 2-a）；30% Davidson固定液组睾丸间质可见少量空隙，精子生发层分级清晰（图 1-B，图 2-b）；FAA固定液组生精小管内精子生发层局部断裂，精子生发层细胞分级尚清晰，被膜下生精小管萎缩，嗜酸性增强（图 1-C，图 2-c）。

A-10%福尔马林固定液；B-30% Davidsons固定液；C-FAA固定液图 1 3种不同的固定液固定24 h后SD大鼠睾丸组织病理学变化（HE 5.0 × 10）Fig. 1 Histopathological changes of testis after fixed for 24 h by three kinds of fixatives in SD rats (HE 5.0 × 10)

a-10%福尔马林固定液；b-30% Davidsons固定液；c-FAA固定液图 2 3种不同的固定液固定24 h后SD大鼠睾丸组织病理学变化（HE 20.0 × 10）Fig. 1 Histopathological changes of testis after fixed for 24 h by three kinds of fixatives in SD rats (HE 20.0 × 10)

镜下结果显示：①在10%福尔马林中固定24 h组睾丸间质可见较大空隙，精子生发层排列整齐，分级较明显，部分生精小管可见裂隙（图 3-A，图 4-a）；固定48 h组睾丸间质可见明显间隙，生精小管收缩明显，精子生发层各级细胞较明显（图 3-B，图 4-b）；②在30% Davidson固定液中固定24 h组睾丸间质可见少量空隙，精子生发层分级清晰（图 3-C，图 4-c）；固定48 h组睾丸间质可见少量间隙，生精小管收缩不明显，精子生发层各级细胞清晰可见（图 3-D，图 4-d）；③在FAA固定液中固定24 h组睾丸生精小管内精子生发层局部断裂，各级细胞分级不明显，被膜下生精小管萎缩，嗜酸性增强（图 3-E，图 4-e）；固定48 h组睾丸间质可见少量间隙，部分生精小管内精子生发层断裂，被膜下生精小管萎缩，嗜酸性增强（图 3-F，图 4-f）。

A- 10%福尔马林固定液固定24 h；B- 30% Davidson固定液固定24 h；C- FAA固定液固定24 h；D- 10%福尔马林固定液固定48 h；E- 30% Davidson固定液固定48 h；F- FAA固定液固定48 h图 3 3同种固定液分别固定24 h、48 h后SD大鼠睾丸组织病理学变化（HE 5.0 × 10）Fig. 3 Histopathological changes of testis after fixed 24 and 48 h by same fixatives in SD rats (HE 5.0 × 10)

a- 10%福尔马林固定液固定24 h；b- 30% Davidson固定液固定24 h；c- FAA固定液固定24 h；d- 10%福尔马林固定液固定48 h；e- 30% Davidson固定液固定48 h；f- FAA固定液固定48 h图 4 同种固定液分别固定24 h、48 h后SD大鼠睾丸组织病理学变化（HE 20.0 × 10）Fig. 4 Histopathological changes of testis after fixed for 24 h and 48 h by fixatives in SD rats (HE 20.0 × 10)

组织固定的目的^[4]在于保持组织细胞的形态结构、杀灭组织内的细菌、增强组织的硬度，同时可提高折光率以便光学显微镜下的观察。目前常用的固定方法包括：①物理学方法，如低温冷冻，干冰冰冻真空脱水，石蜡渗入法；②化学方法，采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法，也是组织病理学检查中石蜡切片制作最常用的固定方法。

固定过程中组织结构的保存效果受多种因素的影响，如固定液种类、温度、固定时间以及固定后处理方法等。因此选择最合适的固定条件有助于最大程度的保证组织的完整性。

固定液的种类直接影响组织保存和固定的效果^[5]，10%中性福尔马林固定液由甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及蒸馏水按一定比例组成，其主要利用甲醛使蛋白质分子发生交联聚合而产生固定作用，也是目前化学试剂固定组织中应用最多的方法之一；30% Davidson固定液则由10%中性福尔马林溶液、冰醋酸、95%乙醇及蒸馏水依据比例配制而成，2002年Latendresse等^[6]进行了改良Davidsons固定液与Bouins液对大鼠睾丸固定的对比研究，结果显示改良Davidsons固定液引起的曲细精管萎缩不明显，形态也更清晰，FAA固定液又称标准固定液，由甲醛、冰醋酸、70%乙醇按比例配成，有文献报道^[7]，FAA固定液固定睾丸后对形态学观察效果比较好。本研究通过上述3种固定液对SD大鼠睾丸组织病理学变化的影响发现：30% Davidsons固定24 h后睾丸间质出现少量空隙、精子生发层分级清晰，10%中性福尔马林和FAA组睾丸间质空隙较大，精子生发层较为完整，生精小管出现不同程度的裂隙或萎缩，此结果与Latendresse的研究结果类似，说明Davidsons固定液对于睾丸固定具有更好地优势（图 1、2）。

固定时间的长短对病理组织的完整性也有很大的影响^[8]。固定时间不足固定液无法完全渗入组织内部、标本固定不均匀，固定时间过长则会使组织扭曲变脆，影响后续取材制片。本研究通过在同一种固定液中对SD大鼠睾丸分别固定24、48 h后观察发现：固定时间对SD大鼠睾丸组织具有一定程度的影响，同一种固定液固定24 h或48 h后均可见睾丸间质出现间隙，48 h组还可见生精小管出现裂隙或收缩，精子生发层部分断裂（图 3、4）。

综上所述，本试验条件下，SD大鼠睾丸组织分别在3种固定液中固定24 h和48 h后：① 30% Davidsons固定液固定24 h可更好地保持睾丸组织的形态结构，变化程度较小；②固定时间对睾丸组织的病理学变化具有一定程度的影响，固定24 h比48 h更能保持睾丸组织结构的完整性。