蝎毒多肽提取物（Polypeptide extract from scorpion venom，PESV）是本实验室从东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的蝎毒中分离提取的由50～60个氨基酸组成的多肽提取物，耐热、pH稳定，具有多种生物活性。东亚钳蝎（俗称马氏钳蝎），药用历史悠久，其药性味咸、辛、平、有小毒，具有平肝熄风、攻毒散结、通络止痛等功效。前期研究证实，PESV有显著的抗肿瘤作用^{[1, 2, 3]}，对机体T细胞等免疫细胞功能具有促进作用^{[1, 4, 5]}。中医药配合肿瘤化疗，可增效减毒，并改善患者低下的免疫功能^[6]。本研究通过建立肝癌H₂₂荷瘤小鼠模型，研究PESV对5-Fu干预H₂₂荷瘤小鼠免疫功能的影响，并探讨其免疫调节作用机制。

Balb/c小鼠100只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，实验动物生产许可证号SCXK（鲁）20130009，购自山东大学实验动物中心。H₂₂肝癌腹水瘤株，由山东省医学科学院药物研究所赠予。

蝎毒冻干粉（粗提物，由山东省医学科学院药物研究谢砚英研究员鉴定），购自邹平县蝎蚁生物科技有限公司，外观呈黄色粉末状，易溶于水。PESV由本实验室提取^[7]，经HPLC 分析，为相对分子质量6 000～7 000的多肽混合物粉末，质量分数89.1%，使用前用生理盐水溶解稀释到所需浓度。化疗药物：注射用5-Fu，批号FA131103，购自上海旭东海普药业有限公司。

RPMI 1640培养液，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司；FITC标记小鼠CD 4、Dx 5抗体、PE标记小鼠CD 8抗体、Pc 5标记小鼠CD 3抗体，均购自美国BD公司；血清细胞因子IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒，美国Ebioscience公司。

leicaDM4000B显微镜，德国徕卡仪器有限公司；BD FACS Aria III流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司；Multiskan Ascent酶标仪，美国Thermo公司。

将液氮冻存的小鼠H₂₂腹水瘤株于37 ℃水浴锅中快速解冻，加入10 mL RPMI 1640培养液，振摇混匀，2 000 r/min，离心5 min，离心2次，除去冻存液，10 mL RPMI 1640培养液重悬，在无菌环境下传代。第三代用于实验。

无菌抽取传代第7天的H₂₂腹水肿瘤细胞，加入灭菌生理盐水调整密度为4×10⁶/mL，于小鼠的右腋下sc 0.2 mL（第0天），接种80只小鼠。

第6天将成瘤小鼠按成瘤体积随机分为模型组、化疗组及5-Fu联合PESV高、低剂量（40、10 mg/kg）组，每组20只。另取20只正常小鼠作为对照组。化疗组：于第8、15、22天ip 20 mg/kg 5-Fu；模型组：于同一时间ip等体积的生理盐水；PESV高、低剂量组：与化疗组同法ip 5-Fu，于第5、6、7、12、13、14、19、20、21、26、27、28天ig PESV；第29天结束实验。每天观察小鼠肿瘤生长情况。于末次给药24 h内眼球取血，37℃培养箱放1 h，然后4℃冰箱静置5 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，储存于−80℃，用于ELISA检测。

处死小鼠后无菌取脾脏，用剪刀剔除结缔组织和脂肪并剪碎脾脏，用注射器针芯轻轻挤压脾组织过200目不锈钢丝网研磨，制成细胞悬液，再过400目不锈钢丝网以便形成单个细胞悬液，离心后低渗处理去除红细胞，再次离心洗涤，重悬细胞制成脾细胞悬液，用于流式细胞术检测。

2.5.1 于化疗前和停药24 h后以分析天平各测体质量1次。末次给药24 h各组小鼠眼球采血后，以颈椎脱臼法处死，从腋部皮下完整剥离肿瘤组织，称瘤质量，计算抑瘤率。

抑瘤率＝（模型组平均瘤质量－化疗组或给药组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量

小鼠处死后快速剥离脾脏和胸腺并称质量，计算脾脏和胸腺指数。

脏器指数＝脏器质量/终体质量

鸡红细胞悬液的制备 取鸡血置于有机玻璃的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维，用生理盐水洗涤3次，2 000 r/min离心10 min，弃上清，用生理盐水配成2%的鸡红细胞悬液。

吞噬功能的测定 末次给药24 h后，小鼠ip 2%鸡红细胞悬液1 mL，1 h后颈椎脱臼处死小鼠，立即用酒精棉球消毒，向腹腔注入2.5 mL生理盐水，轻柔腹部1 min，剪开腹部皮肤，用1 mL加样器吸出少量腹腔液滴于载玻片上，置37 ℃孵育30 min，以生理盐水漂洗，晾干。以丙酮-甲醇1∶1溶液固定5 min，加Giemsa-Wright’s染色液染色5 min，蒸馏水漂洗，自然晾干。油镜下观察巨噬细胞，连续选取10个视野，并按以下公式计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数

吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞数/巨噬细胞总数

按照ELISA试剂盒说明书操作步骤进行，待显色终止后即刻用酶标仪检测450 nm的吸光度（A）值。利用酶标软件cvxpt32绘制标准曲线，计算样本中IFN-γ和IL-4的水平。

数据均以表示，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差LSD法分析。

与化疗组比较，PESV高剂量组瘤质量显著降低（P＜0.05）；化疗组小鼠抑瘤率为54.30%，而联合高、低剂量的PESV后，抑瘤率分别增至66.39%、60.01%。化疗组脾脏指数和胸腺指数较模型组均显著下降（P＜0.01），PESV低、高剂量组的脾脏指数、高剂量组胸腺指数均显著高于化疗组（P＜0.05、0.01、0.001）。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 PESV对H22实体瘤的抑制作用($\bar x \pm s$,n = 20) Table 1 Inhibitory effect of PESV on H22 solid tumor($\bar x \pm s$,n = 20) 分组 剂量/(mg∙kg−1) 平均瘤质量/g 抑瘤率/% 脾脏指数/% 胸腺指数/% 对照 — — — 9.37±3.69 3.28±1.34 模型 — 3.49±0.27 — 7.52±2.19△ 2.63±1.41△ 化疗 20 1.67±0.53## 54.30 5.73±2.48## 1.72±0.70## PESV 40 1.21±0.25*## 66.39 8.67±5.03*** 2.71±1.15** 10 1.54±0.46## 60.01 6.45±2.66 1.96±0.62 与对照组比较：△P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与化疗组比较：P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 △P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group; P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs chemotherapy group

表 1 PESV对H22实体瘤的抑制作用($\bar x \pm s$,n = 20) Table 1 Inhibitory effect of PESV on H22 solid tumor($\bar x \pm s$,n = 20)

与模型组比较，化疗组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数均显著降低（P＜0.01）。PESV高、低剂量组均可显著提高吞噬率和吞噬指数，与化疗组比较差异显著（P＜0.05、0.01、0.001）。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 PESV对H22荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响($\bar x \pm s$,n = 20) Table 2 Effect of PESV on phagocytic function of macrophage in H22 hepatoma-bearing mice($\bar x \pm s$,n = 20) 分组 剂量/(mg∙kg−1) 吞噬率/% 吞噬指数 对照 — 47.3±4.5 0.82±0.07 模型 — 42.5±5.7△ 0.64±0.03△ 化疗 20 26.9±3.4## 0.36±0.08## PESV 40 41.8±5.1** 0.75±0.19*** 10 30.7±4.2 0.50±0.14 与对照组比较：△P＜0.05；与模型组比较： ##P＜0.01；与化疗组比较：P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 △P < 0.05 vs control group; ##P < 0.01 vs model group; P < 0.05 **P < 0.01 ***P< 0.001 vs chemotherapy group,same as below

表 2 PESV对H22荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响($\bar x \pm s$,n = 20) Table 2 Effect of PESV on phagocytic function of macrophage in H22 hepatoma-bearing mice($\bar x \pm s$,n = 20)

与模型组比较，化疗组小鼠脾细胞中CD4⁺T/CD8⁺T值降低（P＜0.05）。与化疗组比较，PESV低剂量组CD4⁺/CD8⁺值略有升高，差异不显著；PESV高剂量组CD4⁺/CD8⁺值明显升高，差异显著（P＜0.01）。结果见图 1。NK细胞和NKT细胞百分比在模型组、化疗组明显低于对照组（P＜0.05、0.01）；PESV高、低剂量组均显著高于化疗组（P＜0.01、0.05）。结果见图 2。

A-脾脏单个核细胞中CD4、CD8流式细胞仪检测结果散点图；B-脾脏单个核细胞中CD4+/CD8+的比较；与模型组比较：**P＜0.01 A-Scatter detection results of CD4 and CD8 flow cytometry in single nucleus cells of spleen; B. Comparison of CD4+ T cell and CD8+ T cell ratio in spleen mononuclear cells; **P＜0.01 vs model group图 1 PESV对H22荷瘤小鼠T细胞亚群的影响Fig. 1 Effectof PESV on T cell subset in H22 hepatoma-bearing mice

A -脾脏单个核细胞中NK、NKT流式细胞仪检测结果散点图；B-脾脏单个核细胞中NK细胞百分率的比较；C -脾脏单个核细胞中NK细胞百分率的比较；与模型组比较：P＜0.05，**P＜0.01 A- Scatter detection results of NK and NKT flow cytometry in single nucleus cells of spleen; B- Comparison of the percentage of NK cells in spleen mononuclear cells; C- Comparison of the percentage of NKT cells in spleen mononuclear cells; P＜0.05,**P＜0.01 vs model group图 2 PESV对H22荷瘤小鼠NK细胞和NKT细胞的影响Fig. 2 Effectof PESV on NK cell and NKT cell in H22 hepatoma-bearing mice

3.4 对荷瘤小鼠外周血IFN-γ和IL-4水平的影响

与对照组比较，模型小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ水平明显降低，Th2型细胞因子IL-4水平明显增高（P＜0.01）；化疗组与模型组比较，IFN-γ水平降低，IL-4水平明显增高（P＜0.01）；与化疗组比较，PESV高、低剂量组IFN-γ水平明显增高，IL-4水平显著降低（P＜0.05、0.01）。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 两组大鼠体质量、肝质量、脾质量比较($\bar x \pm s$,n = 20) Table 3 Effect of PESV on serum level of IFN-γ and IL-4 in H22 hepatoma-bearing mice($\bar x \pm s$,n = 20) 分组 剂量/(mg∙kg−1) IFN-γ/(μg∙mL−1) IL-4/(μg∙mL−1) 对照 — 11.37±5.94 9.83±8.05 模型 — 7.53±6.02△△ 15.35±5.17△△ 化疗 20 5.83±4.65# 17.74±3.71# PESV 40 8.32±4.62** 13.63±3.81** 10 6.21±5.28 15.98±4.94 与对照组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05；与化疗组比较：P＜0.05 **P＜0.01 △△P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs tumor-bearing group; P < 0.05 **P < 0.01 vs chemotherapy group

表 3 PESV对H22荷瘤小鼠外周血IFN-γ和IL-4水平的($\bar x \pm s$,n = 20) Table 3 Effect of PESV on serum level of IFN-γ and IL-4 in H22 hepatoma-bearing mice($\bar x \pm s$,n = 20)

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，每年新增病例我国约占半数，已成为肝癌发病最集中的地区之一，严重威胁人们的生命健康。肝癌起病隐匿，进展迅速，大部分患者就诊时已属中晚期，往往已失去手术治疗的机会。当前治疗原发性肝癌常用药物首推氟尿嘧啶，其次是阿霉素、顺铂和丝裂霉素，但这些药物由于产生多药耐药，毒副作用大，还常常降低患者免疫功能等缺点而限制临床应用效果^[8]。

研究表明，若在肿瘤化疗的同时配合中医中药治疗，能降低化疗的毒副作用，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高机体免疫功能。近年来，研究发现中草药无论在抑制肿瘤细胞还是在肿瘤的病后调理、改善体征、减轻放化疗不良反应等方面均发挥了重要作用^[9]。临床实践证明一些复方的覆盖面较广，但是作用较弱；而一些单味中药定向作用于某些肿瘤，且抑瘤效果显著^[10]。

本实验结果显示，5-Fu联用低、高剂量的PESV后，荷瘤小鼠的瘤质量显著减小（P＜0.01），抑瘤率较化疗组明显提高，表明PESV可增强5-Fu对荷瘤小鼠的抑瘤作用。5-Fu化疗后，荷瘤小鼠的脾脏和胸腺指数均显著下降（P＜0.01），PESV高、低剂量组小鼠的脾脏和胸腺指数则显著上升，表明PESV可逆转5-Fu化疗引起免疫器官的萎缩，从而减轻免疫器官的损伤，保护免疫器官。

巨噬细胞在体内扮演清道夫角色，可以直接吞噬外来抗原，其吞噬功能可直观反映机体非特异性免疫水平^[11]。它可以直接与瘤细胞结合发挥杀瘤效应；也可以分泌某些产物抑制肿瘤生长；还可以通过ADCC作用杀伤肿瘤^[12]。本研究结果显示，化疗组显著降低了巨噬细胞吞噬率和吞噬指数（P＜0.01），表明5-Fu对机体非特异性免疫有抑制作用。PESV高、低剂量组均可显著提高吞噬率和吞噬指数，与化疗组比较具有显著性差异（P＜0.05、0.01），说明PESV能抑制5-Fu对机体非特异性免疫有抑制作用，促进荷瘤机体非特异性免疫力的提高。

机体的免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞在肿瘤免疫中起调控作用，成熟的T淋巴细胞分为CD4⁺和CD8⁺两个亚群，CD4⁺/CD8⁺值是肿瘤患者机体免疫状态的指标之一^{[13, 14]}，Th1/Th2细胞亚群水平评价机体免疫状态和免疫能力的一个综合指标，IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2细胞分泌最特异的细胞因子，检测血清中IFN-γ和IL-4水平对维持Th1/Th2平衡起重要作用^[15]。本研究结果表明PESV联合用药能升高荷瘤小鼠脾细胞中CD4⁺/CD8⁺值，增加荷瘤小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ水平，同时降低Th2型细胞因子IL-4水平，逆转Th1/Th2漂移，能够拮抗5-Fu的免疫毒性，增强荷瘤机体的免疫力。

NK和NKT细胞作为天然免疫细胞，无需抗原的预先刺激和活化即可发挥细胞毒效应，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作 用^[16]，在本实验中，与化疗组比较，PESV联合用药组能增加荷瘤小鼠脾细胞中NK细胞和NKT细胞百分比，从而提高机体的免疫力。

综上所述，蝎毒多肽提取物提高了荷瘤小鼠的特异性和非特异性免疫功能，逆转化疗引起的免疫功能抑制，这为蝎毒多肽提取物在肿瘤化疗中的应用提供了实验依据。