静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)是肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism,PTE)和深静脉血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)的总称,其中PTE的高发病率、高死亡率和高误诊率已成为全球性的医疗保健问题^[1]。目前国际上,对急性期和稳定期的VTE只有溶栓和抗凝治疗,原因是疾病机制不明,同时也无其他药物治疗。中药作为中医的重要组成部分,用于VTE的防治在国内已有研究,但均仅取其活血化瘀、清热利湿之功效,尚未涉及疾病的本质。本研究通过探讨中药免疫调节、抗炎、抗病毒作用而达到防治VTE的目的,同时将免疫学指标纳入临床疗效评价标准,在国际属前沿研究。并在前期研究基础上,优化中药组方,最终选择同济2号颗粒剂(处方由黄芪提取物颗粒、三七提取物颗粒、金银花提取物颗粒组成)。本文建立了一种高效液相色谱串联质谱电喷雾法同时测定同济2号颗粒中5个主要活性成分黄芪甲苷、绿原酸、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁以及三七皂苷R₁的方法,为全面评价同济2号颗粒剂的质量提供依据。

Agilent QQQ液相色谱/质谱联用仪，包括G1311A型四元输液泵，G1322A型脱气机，G1367B型自动进样器，G1316A型柱温箱；G6410B型三重串联四级杆质谱，配有电喷雾源和MassHunter工作站（美国Agilent公司）；Millipore Simplicity 185型超纯水系统（法国Millipore公司）；Sartorius BP211D天平（德国Sartorius公司）。Vortex Genie 2型漩涡混悬器（美国Vortex公司）；TG16-WS台式高速离心机（中国湘仪公司）。

绿原酸对照品（批号110753-201314，质量分数96.6%）、三七皂苷R₁对照品（批号110745- 200617，纯度未标明，以100%计）、人参皂苷Rg₁对照品（批号110703-201128，质量分数93.4%）、人参皂苷Rb₁对照品（批号110704-201223，质量分数95.9%），黄芪甲苷对照品（批号110781-200613，纯度未标明，以100%计）均购自中国食品药品检定研究院，乙腈、甲酸为色谱纯（美国TEDIA公司），水为自制双蒸水，其余试剂为分析纯。同济2号颗粒由同济医院药剂科提供，批号LOT1305384、LOT1311302、LOT1402307。

色谱柱：YMC-Pack Pro C8柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相组成为A-0.1%甲酸水溶液，B-0.1%甲酸乙腈，采用梯度洗脱，梯度见表 1。体积流量0.4 mL/min，柱温32 ℃，进样量1 μL。

表 1(Table 1)

表 1 流动相梯度组成 Table 1 Gradient of mobile phase 时间/min B/% 0 20 5 40 10 60 15 80 20 20 28 20

表 1 流动相梯度组成 Table 1 Gradient of mobile phase

离子化方式为ESI；离子极性为负离子模式；毛细管电压为4 000 V；干燥器温度350 ℃；干燥气体积流量9 L/min；雾化器（N2）压力241.32 kPa；扫描方式为单离子检测扫描（SIM），参数见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 MRM 检测参数 Table 2 MRM parameters for detection 待测物 m/z 裂解电压/V ΔEMV/V 绿原酸 353 105 200 三七皂苷R1 932 135 200 人参皂苷Rg1 845 145 200 人参皂苷Rb1 1 108 135 200 黄芪甲苷 829 115 200

表 2 MRM 检测参数 Table 2 MRM parameters for detection

精密量取绿原酸5.05 mg、三七皂苷4.76 mg、人参皂苷Rg₁ 4.56 mg、人参皂苷Rb₁ 4.49 mg、黄芪甲苷4.80 mg对照品置10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，既得绿原酸、三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、黄芪甲苷质量浓度分别为0.505、0.476、0.456、0.449、0.480 mg/mL的对照品溶液。

精密称取同济2号颗粒约0.5 g，研匀，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀后超声提取30 min，冷却至室温。补足损失的溶剂，摇匀后取1 mL置离心管中，13 000 r/min离心10 min，取上清5 μL，加流动相至1 mL，离心后进样（200倍稀释）。

按处方比例制备不含对照品的阴性对照样品，制成阴性对照溶液。

分别取对照品、供试品及阴性样品溶液进样，记录图谱（图 1）。结果分离良好，阴性样品无干扰。

1-绿原酸;2-三七皂苷;3-人参皂苷Rg1;4-人参皂苷Rb1;5-黄芪甲苷;1-chlorogenic acid;2-notoginsenoside R1;3-ginsenosides Rg1;4-ginsenosides Rb1;5-astragaloside IV图 1 阴性对照（A）、对照品（B）和供试品（C）质谱图Fig. 1 Mass chromatogram of negative sample (A),references (B),and test sample (C)

精密量取绿原酸、三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、黄芪甲苷储备液60、30、120、80和5 μL至1 mL量瓶中，加流动相（0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液＝1∶1）至刻度。等比稀释，制备系列浓度对照品溶液。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程。结果见表 3，各个成分在线性范围内线性关系良好。

表 3(Table 3)

表 3 标准曲线与线性范围 Table 3 Standard Curve and linear range 化合物 线性范围/(μg∙mL−1) 线性方程 r 绿原酸 0.95～30.3 Y＝24 442.01X－15047.6 0.999 66 三七皂苷R1 0.45～14.28 Y＝4 300.18X－839.20 0.999 55 人参皂苷Rg1 1.71～54.72 Y＝11 129.93X－8 069.29 0.999 65 人参皂苷Rb1 1.12～35.92 Y＝5 735.89.01X－12 833.37 0.999 59 黄芪甲苷 0.075～2.4 Y＝57 863.99X－1 778.32 0.999 82

表 3 标准曲线与线性范围 Table 3 Standard Curve and linear range

5种对照品溶液，取高中低3个浓度，重复进样6次，RSD值分别是绿原酸（2.22%、1.95%、4.85%）、三七皂苷R₁（3.22%、2.51%、1.88%）、人参皂苷Rg₁（5.44%、3.22%、6.49%）、人参皂苷Rb₁（4.26%、2.15%、4.16%）、黄芪甲苷（3.88%、6.44%、8.55%），满足精密测定的要求。

取同一批次（LOT1305384）样品，按“2.3”方法制备样品溶液，于室温下分别放置0、4 h后取样，在优化条件下测定，结果显示5种目标物的平均质量浓度的RSD分别为9.30%、2.64%、12.34%、8.95%、9.22%。表明供试品溶液在4 h内稳定。

取同一批次（LOT1305384）样品6份，按“2.3”方法制备样品溶液，在优化条件下测定峰面积，计算各成分含量及RSD值。结果RSD值分别是绿原酸1.95%、三七皂苷R₁2.51%、人参皂苷Rg₁ 3.22%、人参皂苷Rb₁ 2.15%、黄芪甲苷6.44%。

精密称定同一批号（LOT1305384）样品3份，分别精密加入低中高3个浓度的对照品溶液，按“2.2”项下操作。每份连续进样3次，计算回收率，结果见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 回收率试验结果 Table 4 Results of recovery test 化合物 样品量 /μg 加入量 /μg 测得量 /μg 回收率 /% RSD/% 绿原酸 6.36 3.03 9.55 105.28 2.59 6.06 14.13 117.09 1.83 12.12 19.02 104.46 1.98 三七皂苷R1 1.23 1.43 2.58 94.41 3.59 2.86 3.75 96.29 4.48 5.71 7.23 105.08 5.45 人参皂苷Rg1 7.06 5.47 13.01 108.78 1.56 10.94 19.37 110.87 2.73 21.89 29.52 102.60 4.34 人参皂苷Rb1 4.35 3.59 8.03 102.51 4.64 7.18 12.00 106.64 2.89 14.37 19.55 105.78 3.62 黄芪甲苷 0.12 0.24 0.38 108.33 3.98 0.48 0.62 103.75 3.35 0.96 1.06 97.92 2.64

表 4 回收率试验结果 Table 4 Results of recovery test

取3批同济2号颗粒样品,每批3份,分别按"2.3 "项下方法制备供试品溶液,按" 2.2"色谱条件测定,结果(表 5)表明,3个批次的颗粒稳定性良好。

表 5(Table 5)

表 5 样品测定结果(n=3) Table 5 Contents of samples(n=3) 批号 绿原酸 三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 质量分数/(μg∙g−1) RSD/% 质量分数/(μg∙g−1) RSD/% 质量分数/(μg∙g−1) RSD/% LOT1305384 2 373.84±18.86 0.79 497.76±12.64 2.54 2 678.84±44.21 1.65 LOT1311302 2 754.07±134.58 4.89 515.90± 3.92 0.76 2 467.11±86.15 3.49 LOT1402307 1 961.78±8.10 0.41 512.08±9.84 1.92 3 135.15±14.72 0.47 批号 人参皂苷Rb1 黄芪甲苷 质量分数/(μg∙g−1) RSD/% 质量分数/(μg∙g−1) RSD/% LOT1305384 1 657.46±19.12 1.15 48.75±2.19 4.50 LOT1311302 1 516.22±74.11 4.89 42.87±0.37 0.87 LOT1402307 1 987.42±34.17 1.72 1 961.78±8.10 0.41

表 5 样品测定结果(n=3) Table 5 Contents of samples(n=3)

在质谱条件摸索中，结合参考文献^{[2, 3, 4, 5, 6]}，分别采用乙腈-甲酸铵缓冲液、甲醇-甲酸铵水溶液、甲酸乙腈溶液-甲酸水溶液等。结果显示，在以水（0.1%甲酸）-乙腈（0.1%甲酸）为流动相的条件下，梯度洗脱5种成分分离效果好，可显著改善峰前伸和拖尾现象，提高灵敏度，缩短不同极性化合物之间的分离时间，故选定其为流动相。

本实验中前期采用的是Agilent XDB-C₁₈柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），但是预实验的结果并不理想，5种成分的分离度不佳，尤其是人参皂苷Rg₁、Rb与三七皂苷的保留时间几乎一致，亦无法通过调整流动相来进行有效分离。因此更换了色谱柱，以YMC-Pack Pro的C₈柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）进行试验，得到了较好的分离度。

中药复方药物成分复杂，复杂的化学成分易对仪器测试造成干扰。因此本研究对提取溶剂及提取时间进行优化和筛选。溶剂考察了100%甲醇、50%甲醇、水3种溶剂。超声提取时间考察了10、20、30、45、60 min 5个时间段，以LC-MS检测滴丸中5种成分总量。结果表明，以50%甲醇为提取溶剂，超声提取30 min的回收率值最高。

本方法主要采用的是负离子模式，5个待测物中绿原酸、三七皂苷R₁、人参皂苷Rb₁的一级质谱表现出强的[M－H]⁻准分子离子峰，而人参皂苷Rg₁和黄芪甲苷产生的准分子离子峰均为[M＋45]⁻峰，推测其可能是[M＋HCOO]⁻或[M＋2Na－H]⁻等离子^[7]。

本实验建立的HPLC-MS/MS法可在短时间内快速分离同济2号颗粒中的5种主要药效成分，快速、灵敏、准确，可用于同济2号颗粒中绿原酸、三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、黄芪甲苷的定量测定，为该药的全面质量控制提供依据。