肺癌是当今世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，且呈上升趋势，目前全球范围内新发肺癌患者每年已经超过100万例，其死亡率在男性和女性患者中均占恶性肿瘤死亡率的第一位。另有国外资料显示肺癌的病理学类型发生了明显变化：肺腺癌发病率迅速增加，目前已取代肺鳞癌的发生率，已成为最常见的肺癌病理类型。尽管采用了手术、放疗和化疗等综合治疗措施，由于转移和多药耐药等原因，非小细胞肺癌5年生存率仍低于10%。近年来，新兴的肿瘤分子靶向治疗意在针对肿瘤内特异的分子治疗靶点，利用一定的分子技术阻断分子的生物学功能，进而从分子水平逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，达到抑制肿瘤生长的目的^[1]。中医药作为肿瘤综合治疗的手段之一被临床广泛应用。目前普遍认为中医药在预防肿瘤，增强患者的免疫功能，对放化疗的减毒增效，抗复发转移及延长患者的生存期，改善生活质量等方面均有其独特作用。多年来，大量临床研究结果表明^{[2, 3, 4, 5, 6]}，以消岩汤为基础的中医药对非小细胞肺癌具有明显的抑瘤及减毒增效作用，本实验以RNA干扰技术为切入点，从基因角度探讨消岩汤对肺腺癌A549细胞survivin蛋白表达的影响，明确消岩汤抗肿瘤作用靶点及作用机制，为消岩汤在临床抗肿瘤治疗中提供有力的理论依据。

人肺腺癌A549细胞、RPMI1640 培养基、新生牛血清购、MTT（四甲基偶氮唑盐）、二甲基亚砜（DMSO）、免疫组化试剂盒、survivin抗体均购自天津科瑞杰生物技术开发有限公司。

消岩汤是天津中医药大学第一附属医院院内制剂，制剂号40019，严格按照院内制剂标准进行制备。消岩汤由生黄芪30 g、太子参15 g、夏枯草10 g、姜黄15 g、郁金10 g、白花蛇舌草15 g组成，选取标准中药饮片，煎前先用凉水浸泡30 min，用水量为生药量的8倍，武火煎沸后，文火煎30 min，滤出药液；再加6倍量水煎沸后文火煎20 min，滤出药液，合并2次煎液，置70～80 ℃水浴中浓缩至 100 mL，相当于生药0.42 g/mL，放置4 ℃冰箱中保存。

实验分为对照组，转染组，消岩汤低、中、高剂量组及转染+消岩汤低、中、高剂量组。对照组为空白细胞，不做任何处理；转染组转染sh-survivin干扰序列；消岩汤低、中、高剂量组分别加入终质量浓度为10、15、25 mg/mL的消岩汤；转染+消岩汤低、中、高剂量组在转染sh-survivin干扰序列后分别加入终质量浓度为10、15、25 mg/mL的消岩汤。

分别检测不同浓度消岩汤（0、10、15、20 mg/mL）处理不同时间（24、48 h）对A549细胞增殖的影响。取对数生长期，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，种于24孔板中，加入不同浓度的中药分别处理不同时间后，弃上清。每孔加入MTT（10 mg/mL），培养4 h，弃上清，避光加入DMSO 150 μL，震荡，用酶标仪检测吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率。

抑制率＝1－加药组A值/对照组A值

采用细胞盖玻片爬片法，survivin蛋白检测采用SABC法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，一抗为兔抗人survivin单克隆抗体，工作浓度为1∶100。免疫组化结果判定以阳性细胞百分率及着色强度综合计分作半定量分析，并利用HPIAS21000彩色病理图文报告系统测定积分吸光度（IA）值进行蛋白表达强度的定量分析。

把对数生长期的人肺腺癌A549细胞以1×10⁵个/mL的浓度接种于六孔板中，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养24 h后，弃上清，分别予以不同处理，24 h后收集各组细胞，300目尼龙网过滤细胞悬液，采用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法，上流式细胞仪检测，计数10 000个细胞，测定细胞凋亡数量。

结果可见，作用24 h各组细胞的药物毒性不明显，作用48 h后各组细胞的药物毒性作用比较明显。加入终质量浓度15 mg/mL的消岩汤与转染组二者的抑制率无明显差异，均显著高于终质量浓度10 mg/mL和终质量浓度25 mg/mL的消岩汤组；但转染组联合消岩汤组的抑制率显著高于单纯转染组及单纯中药组。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各不同处理组作用于A549细胞后的抑制率 Table 1 Inhibitory rate of A549 cells in different treatment groups 分组 剂量/(mg∙mL−1) A 抑制率/% 对照 — 0.695 — 转染 — 0.226 0.675 消岩汤 10 0.316 0.545 15 0.212 0.695 25 0.308 0.557 转染+消岩汤 10 0.092 0.868 15 0.074 0.894 25 0.089 0.872

表 1 各不同处理组作用于A549细胞后的抑制率 Table 1 Inhibitory rate of A549 cells in different treatment groups

结果可见转染组对Survivin蛋白表达的抑制率明显高于单纯中药组，但显著低于转染组联合中药组。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 Survivin蛋白表达抑制率 Table 2 Inhibitory rate of survivin protein expression 分组 剂量/(mg∙mL−1) IA 抑制率/% 对照 — 0.389 — 转染 — 0.142 0.635 消岩汤 10 0.267 0.314 15 0.217 0.442 25 0.209 0.463 转染+消岩汤 10 0.124 0.681 15 0.101 0.741 25 0.109 0.720

表 2 Survivin蛋白表达抑制率 Table 2 Inhibitory rate of survivin protein expression

在流式细胞术双参数散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚 期凋亡细胞，左上象限是非活细胞，即坏死细胞。

从图 1中可看出，与对照组凋亡率1.66%相比较，转染组、消岩汤15 mg/mL组、消岩汤15 mg/mL联合转染组细胞凋亡率分别为40.0%、27.07%、56.49%。

A-空白细胞；B-转染sh-survivin干扰序列；C-加入终质量浓度15 mg/mL的消岩汤；D-转染sh-survivin干扰序列后加入终质量浓度15 mg/mL的消岩汤图 1 流式细胞仪Annexin V-TITC/PI双染检测A549细胞凋亡Fig. 1 Annexin V-TITC/PI double dye detection of apoptosis of A549 cells by flow cytometry instrument

消岩汤是贾英杰教授根据多年肿瘤临床经验并结合现代医学理论概括出肿瘤发病病机：正气内虚，邪留毒聚，瘀毒并存，久病入络，并且这一病机贯穿肿瘤的发生、发展，直至死亡整个过程，而现代医学的手术、放化疗又会加深此病机发展，从而提 出“祛瘀解毒，扶正抗癌”肿瘤中医治则。在此基础上依据中药功效及现代药理研究拟定 “扶正解毒祛瘀”为大法的中药汤剂（院内制剂号为40019），其中黄芪、太子参滋阴益气，扶正抗癌；夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草清热解毒、软坚散结；姜黄、郁金行气散结、活血祛瘀；蜂房搜剔络脉中之瘀毒。全方祛邪而不伤正，全面调节身体内环境的平衡。本课题组进行了大量的前期研究成功地证实消岩汤具有良好的抗肺癌新生血管的作用，能够提高化疗的NSCLC患者的近期疗效，改善生活质量。

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是继Bcl-2家族后发现的又一类凋亡调控蛋白家族，是凋亡抑制蛋白基因表达的产物，因抑制细胞凋亡和参与肿瘤的发生成为近年来研究的热门靶点^[7]。Survivin是近年新发现的IAP家族成员，是该家族中迄今为止发现的相对分子质量最小、抗凋亡作用最强者，它选择性地表达于恶性肿瘤组织中，而在除胸腺和生殖腺外的正常成人组织中不表达，这种特点使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。

RNA干扰技术是基因沉默的有力手段，宿主通过RNA干扰抑制病毒等外源核苷酸的表达，从而维护自身基因组的稳定性，通过人工导入一段与目的基因同源的双链RNA序列使其mRNA降解，表达缺失，实现基因敲除。目前实验室进行RNA干扰常用的小干扰RNA（siRNA）片段来源主要有两种，一是细胞外合成，二是细胞内合成，包括以质粒为载体的细胞内合成和以病毒为载体的细胞内合成。经改造的质粒和病毒为载体的siRNA片段可较长时间在真核细胞内表达，为肿瘤的基因治疗开辟了新的途径。以RNA干扰技术作用肺癌细胞，细胞的Survivin mRNA表达下降，凋亡率增高，且细胞的增殖和恶性侵袭能力被明显抑制。

本实验以人肺腺癌A549细胞为载体，开展了消岩汤对肺癌细胞凋亡作用的研究。实验结果显示，消岩汤能有效地抑制人肺腺癌A549的细胞增殖，运用消岩汤作用细胞24 h后，侵袭的细胞数明显减少，该方作用48 h后可以诱导肿瘤细胞凋亡；消岩汤中剂量组与转染sh-survivin组抑制率相当，不同剂量的消岩汤均可协同sh-survivin使肺癌细胞凋亡率增加。

在此基础上，本课题组还将从体内实验对该方的诱导肿瘤细胞凋亡及信号转导通路方面开展进一步的实验研究，从细胞-分子-基因等多水平阐明消岩汤抗肺癌作用机制，为中药复方抗肿瘤提供有力的实验依据。