间充质干细胞是来源于中胚层的一类多能干细胞，在细胞治疗应用中具有广阔的前景，主要有两个特征：自我更新和分化潜能，因此这些细胞能够在体外扩增，可来源于不同的器官和组织，间充质干细胞已经应用于组织修复、自身免疫性疾病等临床治疗中，并取得了良好的治疗效果，经血源性干细胞具有间充质干细胞的特性，由于其来源方便，无伦理问题，增殖活性高等优点，近两年受到极大地关注。本实验拟通过从月经血中提取间充质干细胞，并检测其在小鼠体内的急性毒性，为临床安全使用提供依据。 1 材料与方法 1.1 间充质干细胞

间充质干细胞来源于自愿捐献的女性经血，顺昊细胞生物技术（天津）有限公司实验室分离提取和扩增，用细胞培养液配制至所需浓度的细胞悬液。 1.2 实验动物

ICR小鼠，SPF级，60只，雄雌各半，体质量18.1～21.1 g。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产单位许可证编号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养于天津市新药安全评价研究中心动物房（屏障环境），实验动物使用许可证号：SYXK（津） 2011-0005。饲养环境温度20～26 ℃，湿度40%～70%，换气次数8～10次全新风/h，光照12 h明12 h暗。 1.3 试剂

RPMI-1640培养基（Hyclone），DMEM-F-12培养基（Hyclone），10%胎牛血清（百灵生物科技有限公司），1%青-链霉素（Sigma），胰酶（Sigma），T-75培养瓶（Corning），淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限公司），白蛋白（Baxter）。 1.4 仪器

MCO-18AIC（UV） CO₂培养箱，三洋公司；BD Facsealibur流式细胞仪，碧迪医疗器械有限公司；Eppendorf 5424离心机，艾本德有限公司；CKX22显微镜，奥林巴斯有限公司；E1200-1电子天平，常熟市双杰测试仪器厂生产；ML203电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司生产。 1.5 间充质干细胞的分离提取和扩增

经血干细胞来源于自愿捐献的女性经血，经与捐献者本人签署知情同意书，在无菌条件下收集经血，立即将其转入含RPMI-1640培养基，10%胎牛血清，1%青-链霉素的细胞保护液中，转移至实验室处理分离提取。将采集后的经血及细胞保护液用100 μm细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，离心所得沉淀用20 mL生理盐水重悬，以2∶1的体积比缓慢加入淋巴细胞分离液中，慢升慢降离心，所得细胞用10 mL DMEM-F-12培养基重悬，接种至T-75培养瓶中。细胞生长至80%时，进行胰酶消化传代，离心后弃上清，然后加入细胞培养液吹打混匀，收集细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。 1.6 间充质干细胞的质量检测及表型鉴定

将所培养的细胞悬液进行微生物检测、支原体检测及内毒素检测。细胞培养至所需数量，消化收集所需细胞，调整细胞浓度10⁴/μL，取12支Ep管，每管分FITC-CD90、FITC-CD105、FITCCD73、PE-CD34、PE-CD45、PE-HLA-DR及其各自的同型对照品，室温避光孵育30 min，用PBS洗2次，流式细胞仪检测细胞表面标记。 1.7 间充质干细胞制剂的制备

样品检测合格后，消化细胞，1 500 r/min离心5 min，生理盐水＋1%白蛋白稀释所需数量的细胞样品分别至5×10⁵ cells/mL（临床拟用浓度）、1×10⁷ cells/mL（临床拟用浓度的20倍）。 1.8 急性毒性实验

实验设置2个试验组：低剂量组（1.0×10⁷ cells/kg）尾iv 5×10⁵ cells/mL的间充质干细胞注射液，高剂量组（2.0×10⁸ cells/kg）尾iv 1×10⁷ cells/mL的间充质干细胞注射液；另设置1个对照组，尾iv 0.9%氯化钠注射液，每组20只。各组给药体积均为20 mL/kg。观察给药当天及药后14 d内小鼠的毒性反应症状及死亡情况；给药前和药后第1、3、7、14天进行体质量检查；给药后14 d对所有存活动物进行系统的大体解剖检查，剪取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺，称取脏器质量，并计算脏器系数（脏器系数＝脏器质量/体质量×1 000）。计算各组动物体质量和脏器质量及系数的平均值和标准差（雌雄分别统计），各给药组与对照组之间采用组间t检验进行差异性比较。 2 结果 2.1 间充质干细胞的微生物检测及表型鉴定

由于培养细胞的形状不能作为鉴别细胞类型的主要特征标志，因此，通常都采用流式细胞术对细胞表面抗原分子进行鉴定^{[1, 2, 3]}。本实验中，对所获得的间充质干细胞表面抗原鉴定结果表明该细胞可表达CD29、CD44、CD105等间充质干细胞表面标志，证明所分离的细胞属于间充质干细胞。流式结果表明，细胞表面CD73表达率为98%，CD105表达率为99%，CD34、CD45表达率均小于2%。从经血中提取的间充质干细胞微生物检测、支原体及内毒素检测均为阴性，完全符合间充质干细胞的特性，可以作为制剂在临床上使用^{[4, 5]}。 2.2 急性毒性试验 2.2.1 一般观察及体质量检查 对照组、间充质干细胞低剂量组及高剂量组小鼠在单次给药后均未观察到任何明显的毒性反应症状。在给药后14 d观察期内，小鼠被毛光泽，精神状态和自主活动均正常，分泌物和排泄物亦未见异常。试验期间无动物死亡。实验期间，各给药组小鼠各检查时间点平均体质量与对照组比较均无明显差异，表明间充质干细胞制剂静脉给药对小鼠体质量增长无明显影响。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 间充质干细胞制剂单次静脉给药对小鼠体质量的影响 (x±s, n=20) Table 1 Effect of MSC preparation by single iv adminstration on body weight in mice (x±s, n=20) 组别 剂量/(cells∙mL−1) 检查时间 体质量/g 雄性 雌性 对照 给药前 21.0±0.5 19.1±1.0 药后1 d 22.6±0.8 20.3±1.1 药后3 d 25.4±0.9 21.5±1.5 药后7 d 28.6±0.9 23.7±1.5 药后14 d 31.9±0.8 25.1±1.8 低剂量组 5×105 给药前 21.2±0.7 19.7±1.0 药后1 d 22.6±0.7 20.4±1.1 药后3 d 25.3±1.0 22.1±1.2 药后7 d 28.6±1.5 24.1±1.7 药后14 d 31.9±1.5 25.1±1.7 高剂量组 1×107 给药前 20.8±0.6 19.4±0.8 药后1 d 22.2±1.2 20.2±1.1 药后3 d 24.8±1.3 21.9±0.9 药后7 d 27.9±1.6 23.4±0.9 药后14 d 30.9±1.6 24.2±1.3

表 1 间充质干细胞制剂单次静脉给药对小鼠体质量的影响 (x±s, n=20) Table 1 Effect of MSC preparation by single iv adminstration on body weight in mice (x±s, n=20)

表 2(Table 2)

表 2 间充质干细胞制剂静脉给药对小鼠脏器质量和脏器系数的影响(x±s, n=20) Table 2 Effect of of MSC preparation by single iv adminstration on on organ weight and organ coefficient inmice (x±s, n=20) 组别 剂量/(cells∙mL−1) 项目 脏器质量/g 脏器系数/(mg∙g−1) 雄性 雌性 雄性 雌性 对照 心 0.174±0.020 0.150±0.020 5.453±0.707 5.941±0.555 肝 1.936±0.134 1.449±0.264 60.601±3.549 57.428±7.827 脾 0.120±0.010 0.136±0.043 3.763±0.338 5.393±1.511 肺 0.209±0.024 0.193±0.026 6.533±0.673 7.653±0.711 肾 0.540±0.063 0.364±0.065 16.889±1.826 14.484±2.294 胸腺 0.051±0.017 0.072±0.020 1.603±0.550 2.835±0.776 低剂量组 5×105 心 0.177±0.015 0.146±0.011 5.570±0.486 5.836±0.454 肝 1.919±0.194 1.412±0.170 60.225±4.755 56.283±5.860 脾 0.152±0.020** 0.137±0.030 4.752±0.457** 5.461±1.191 肺 0.230±0.017 0.211±0.027 7.222±0.440 8.401±0.923 肾 0.561±0.055 0.351±0.043 17.626±1.524 13.965±1.358 胸腺 0.104±0.175 0.068±0.017 3.330±5.705 2.722±0.730 高剂量组 1×107 心 0.179±0.018 0.151±0.021 5.813±0.566 6.247±0.826 肝 1.845±0.164 1.384±0.158 59.662±2.977 57.092±3.949 脾 0.151±0.017** 0.119±0.021 4.888±0.362** 4.904±0.723 肺 0.236±0.021 0.209±0.032 7.636±0.603** 8.650±1.184 肾 0.543±0.068 0.335±0.032 17.580±1.852 13.861±1.093 胸腺 0.051±0.016 0.068±0.012 1.656±0.504 2.832±0.473 与对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01 *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group

表 2 间充质干细胞制剂静脉给药对小鼠脏器质量和脏器系数的影响(x±s, n>=20) Table 2 Effect of of MSC preparation by single iv adminstration on on organ weight and organ coefficient inmice (x±s, n=20)

小鼠单次静脉注射5×10⁵ cells/mL（临床拟用浓度）和1×10⁷ cells/mL（远大于临床拟用浓度）的间充质干细胞制剂，除引起动物肺脏及脾脏增重外，未出现其他明显毒性反应，也未观察到动物死亡。实验结果提示，间充质干细胞制剂临床单次使用的耐受性较好。 4 讨论

根据文献^{[6, 7, 8]}报道，悬浮的MSCs的平均直径为15～19 μm，而肺部毛细血管的直径为10～15 μm，另外，MSCs具有很强的附着能力，因此会大量滞留在肺部。多数研究者证实移植的BMSCs往往易于分布在肺、脾、肾和皮肤等含血量多的器官中，而肾脏、心脏、肝脏和肌肉等也有报道，可见其分布的部位虽然广泛，但对某些脏器存在倾向性。含血量多的器官具有丰富的微血管系统，血流量大， 血流相对缓慢，使MSCs易于滞留。脾的主要功能是过滤和储存血液，血流丰富，因此MSC在此滞留的可能性大。这可能是本实验中小鼠肺脏和脾脏重量及系数的升高的主要原因，小鼠肺脏和脾脏质量及系数的升高可能对肺脏和脾脏具有一定的保护和修复功能。