海藻和昆布是中医古籍中常用的药对组合，海藻为马尾藻科植物海蒿子Sargassum pallidum (Turn.) 或羊栖菜Sargassum fusiforme (Harv.)，昆布为海带科植物海带Laminaria japonica (Aresch.) 或翅掌科植物昆布Ecklonia kurome (Okam.)^[1]。两药配伍主要用于瘿瘤、瘰疬、痰饮水肿等治疗，一般认为其水溶性的多糖组分发挥药效作用^{[2, 3, 4]}。

从海带、羊栖菜等海藻中提取分离的多糖成分能提高机体免疫力，产生抗肿瘤、抗病毒和降血糖等多种生物学活性^{[5, 6]}。但是，有关这些藻类多糖在较高给药剂量下对肝微粒药物代谢酶的影响及肝毒性研究鲜有报道。

本研究以海藻–昆布药对的主体成分粗多糖为试验对象，建立大鼠肝微粒体孵育体系，通过测定非那西丁（CYP1A2）、氯唑沙宗（CYP2E1）及咪达唑仑（CYP3A4）等3种CYP450同工酶的特异性探针药物的代谢和降解状况来推测其对肝药酶的诱导或抑制作用，并以肝病理切片的检查结果对肝毒性进行表征，为临床合理用药提供试验依据。

Dionex U3000高效液相色谱系统（美国Dionex公司），配备DAD检测器，自动进样器及Chromeleon 7.0色谱工作站；XS205Du十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；OUAN CR3i台式高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）。KD-BM生物组织包埋机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；JJ-12J脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；JB-L5冻台（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016生物组织切片机（上海徕卡仪器有限公司）；KD-P摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；DGX-9003B烘箱（上海福玛实验设备有限公司） 1.2 药材

海藻、昆布中药饮片，产地福建，批号131001，执行标准：《中国药典》2010版。

CYP1A2、CYP2E1、CYP3A）及代谢产物对乙酰氨基酚、1-羟基咪达唑仑以及6-羟基氯唑沙宗由中国科学院上海药物研究所药物代谢研究中心及瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司提供；内标原儿茶酸、利眠宁（质量分数99.0%）由上海市药物（中药）代谢产物研究重点实验室提供；NADPH、BCA蛋白浓度测定试剂盒由大连美仑生物技术有限公司提供；甲醇、甲酸（色谱纯，美国Prompter公司），其他试剂为国产分析纯化学试剂。

SD大鼠，清洁级，雌雄各半，体质量180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号2007000565992。

称取海藻和昆布中药饮片适量，按古方药对配方1∶1比例^[7]粉碎混匀，加去离子水浸泡过夜，之后于80～90 ℃水浴回流提取2次，1 h/次。提取液经合并后减压浓缩至原体积1/10，离心取上清，缓慢加入5倍体积95%乙醇静置过夜，抽滤沉淀，于60 ℃鼓风干燥得海藻–昆布药对粗多糖提取物^{[8, 9]}。其主要组分为多糖，同时含有一定量的粗蛋白和水溶性色素，具体的质量标准见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 海藻–昆布药对粗多糖的质量标准Table 1 Quality standard of crude polysaccharides extracted from S. fusiforme-L. japonica 指标 标准 理化反应 结果 说明 外观 浅褐色疏松状 蒽酮硫酸反应 阳性 有糖类化合物存在 水溶性 ≥0.3 g/mL 费林试剂反应 阴性 无还原糖 总糖含量 17%～21%（以葡萄糖标定） 碘-碘化钾反应 阴性 无淀粉 粗蛋白含量 12%～15%（BCA试剂盒法[12]） 硫酸咔唑反应 阳性 有糖醛酸存在酸性多糖 水分含量 9%～12%（卡尔费休法[1]） 双缩脲反应 阳性 有蛋白质存在

表 1 海藻–昆布药对粗多糖的质量标准Table 1 Quality standard of crude polysaccharides extracted from S. fusiforme-L. japonica

选取清洁级SD大鼠18只，雌雄兼顾，适应饲养环境1周后，随机分为3组，即海藻–昆布药对粗多糖低、高剂量组和对照组。低、高剂量组分别ig给药10.8、86.4 g/(kg∙d)的粗多糖提取物，连续给药15 d，对照组ig给予相同剂量的生理盐水。

大鼠末次给药禁食不禁水24 h后麻醉处死，剪开腹腔，用冰镇的生理盐水从门静脉冲洗肝脏，滤纸吸干，称质量，切取小片肝叶固定于4%多聚甲醛，另取1 g肝碎块，用50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）制成20%的匀浆，于4 ℃、12 500×g离心15 min，取上清，加CaCl₂至8 mmol/L钙离子浓度，混匀，冰浴5 min，于4 ℃、24 000×g离心25 min，弃上清，得粉色肝微粒体沉淀，用Tris-HCl缓冲液重悬后冻存于−80 ℃。用BCA试剂盒法测定肝微粒体蛋白浓度^[12]。固定24 h后的肝小叶经石蜡包埋切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡，HE染色后透明、中性树胶封片。

参照文献^{[13, 14]}方法，建立孵化体系，在200 μL的孵化体系中分别含NADPH 1.0 mmol/L，MgCl₂ 10.0 mmol/L，KCl 10.0 mmol/L，肝微粒体蛋白0.5 mg/mL，非那西丁10.0 μg/mL（氯唑沙宗5 μg/mL，咪达唑仑5 μg/mL），反应体系中有机溶剂的含量保持在1%以内。

反应体系在37 ℃恒温水浴中预孵化5 min后加入NADPH启动反应，温孵30 min后，以200 μL冷甲醇终止反应，之后准确加入内标溶液20 μL和醋酸乙酯1.6 mL进行液液萃取^[15]，萃取液于30 ℃水浴下氮气流挥干，用200 μL流动相复溶，12 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL置于进样瓶中，自动进样20 μL进行LC-UV分析，内标法定量检测。

色谱柱为Diamonsil TMC₁₈柱（150 mm×4.6 mm，5 m）；CYP1A2代谢样品色谱条件：流动相为甲醇（0.1%甲酸）（A）-水（0.1%甲酸）（C），梯度洗脱（0～5 min：18% A，5～10 min：18%～60% A，10～15 min：60% A）；体积流量1.0 mL/min；检测波长为247 nm，柱温30 ℃；CYP2E1代谢样品色谱条件：流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min：37%～75% A），体积流量1.0 mL/ min；检测波长为287 nm，柱温25 ℃；CYP3A4代谢样品色谱条件：流动相为甲醇（A）-水（0.02%甲酸）（B）梯度洗脱（0～11 min：40%～60% A），体积流量1.0 mL/min；检测波长为223 nm，柱温30 ℃。在该条件下，各探针药物、内标及其代谢产物间的分离度＞1.5，生物样品内源性物质及其他物质均不干扰样品峰和内标峰。

统计数据以$\bar x \pm s$表示，根据测得的反应液中代谢产物的浓度及原型药物的降解结果，计算CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1三种代谢酶亚型对特异性探针药物的代谢反应率，即CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1的活性。用SPSS 19.0软件进行独立样本t检验统计学分析。

按照试验设计，海藻–昆布药对粗多糖连续ig给药SD大鼠15 d后，脱颈椎处死，肝脏系数（g/100 g）和肝微粒体蛋白含量（mg/g）见表 2。统计分析表明，海藻–昆布药对粗多糖连续给药15 d后其肝脏系数和肝微微粒体蛋白水平与对照组相比均无显著差异。

表 2(Table 2)

表 2 肝脏系数及肝微粒体蛋白量比较 (n = 6)Table 2 Comparison on liver coefficient and liver microsome protein content (n = 6) 组别 肝脏系数/% 肝微粒体蛋白/(mg∙g−1) 低剂量 5.17±0.70 5.50±1.78 高剂量 5.34±0.61 5.46±1.07 对照 5.09±0.51 5.38±1.40

表 2 肝脏系数及肝微粒体蛋白量比较 (n = 6)Table 2 Comparison on liver coefficient and liver microsome protein content (n = 6)

按“2.4”的样品预处理步骤进行色谱分析，以探针药物峰面积/内标的峰面积（A_AS/A_IS，Y）和代谢产物峰面积/内标的峰面积（A_AS/A_IS，Y）分别对各自相应的浓度（C，μg/mL）进行加（1/X）线性回归，所得3组探针底物与产物的随行标准曲线方程如下：CYP1A2标准曲线方程Y＝6.105 8X－1.466 6，R²＝0.999 68，线性范围2.061～103.050 μg/mL；对乙酰氨基酚标准曲线方程Y＝5.270 6X－0.348 1，R²＝0.999 25，线性范围0.203～10.150 μg/mL；CYP2E1标准曲线方程Y＝82.157 5X＋1.578 3， R²＝0.998 99，线性范围0.203 4～10.170 μg/mL；6-羟基氯唑沙宗标准曲线方程Y＝52.029 9X＋ 4.839 2，R²＝0.999 14，线性范围0.102 2～5.11 μg/mL；CYP3A4标准曲线方程Y＝19.739 5X－2.004 4，R²＝0.999 28，线性范围0.202 8～10.140 μg/mL；1-羟基咪达唑仑标准曲线方程Y＝27.920 1X－1.502 1，R²＝0.999 89，线性范围0.102 5～5.125 μg/mL。通过以上实时活性测定样品分析批的相应随行标准曲线方程计算得各代谢酶亚型的活性数据，其结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 SD大鼠肝微粒体各代谢酶亚型活性(n = 6)Table 3 Subtype activity of hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes in SD rats (n = 6) 组别 CYP1A2/(μg∙mL−1) 对乙酰氨基酚/(μg∙mL−1) CYP2E1/(μg∙mL−1) 6-羟基氯唑沙宗/(μg∙mL−1) CYP3A4/(μg∙mL−1) 1-羟基咪达唑仑/(μg∙mL−1) 低剂量 8.365 4±0.154 0 0.436 6±0.038 4 3.608 8±0.242 5 1.001 8±0.172 2 3.328 4±0.192 8 0.630 1±0.083 7 高剂量 8.381 6±0.091 6 0.438 5±0.029 3 3.656 9±0.173 8 1.001 7±0.177 5 2.689 4±0.141 9** 1.020 6±0.048 4** 对照 8.376 6±0.128 0 0.449 9±0.028 4 3.676 7±0.288 4 0.953 2±0.129 2 3.436 4±0.070 6 0.583 0±0.066 6 与对照组比较：**P＜0.01 **P＜0.01 vs control group

表 3 SD大鼠肝微粒体各代谢酶亚型活性(n = 6)Table 3 Subtype activity of hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes in SD rats (n = 6)

在低剂量经口给药条件下，肝微粒体代谢酶亚型CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4各探针药物降解剩余量和生成的代谢产物量与对照组相比差异无统计学意义；在高剂量经口给药条件下，肝微粒体代谢酶亚型CYP1A2和CYP2E1各探针药物降解剩余量和生成的代谢产物量与对照组相比无显著差异，但CYP3A4探针药物降解剩余量和生成的代谢产物量与对照组相比差异有极显著（P＜0.01），提示高剂量下大鼠肝微粒体代谢酶3A4亚型被显著诱导。

对照组解剖观察可见肝脏色泽红润、质地柔软、形态大小正常。光镜下肝细胞无肿胀、萎缩或坏死，中央静脉及肝窦未见扩张，门管区胆管无增生，间质无炎细胞浸润。低剂量组解剖观察可见肝脏颜色、质地及形态与对照组无异。光镜下可见肝细胞轻度水肿，肝窦有所扩张，中央静脉及门管区正常。高剂量组解剖观察可见肝脏颜色暗红，形态大小和质地正常。光镜下可见肝细胞水肿呈气球样变并伴随脂肪变，部分肝小叶静脉瘀血并有含铁血黄素沉着，部分门管区有炎细胞浸润，有两例出现了点状坏死和凋亡增多，具体见图 1。

图 1 肝组织切片病变图（HE染色）Fig. 1 Lesions diagram of liver sections (HE staining)

肝脏是药物新陈代谢和解毒的主要场所，其富含催化药物Ⅰ相代谢的CYP450酶，90%以上的代谢性相互作用都是由CYP450酶活性改变引起的，其中代表性的同工酶有CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4^[18]。通过考察这3种代表性同工酶在药物作用下诱导/抑制效果，能有效预测其潜在的药物–药物相互作用影响。

石杰、于玮洁等^{[19, 20]}分别在海洋硫酸多糖药物SPMG-911、AOSC-971和916对大鼠CYP450的影响的离体实验中发现：以褐藻多糖为基础经化学修饰而得的SPMG-911对雄性大鼠CYP1A2具有明显的抑制作用（P＜0.05），但对CYP2E1和CYP3A4无显著影响；以昆布多糖为基础经化学修饰而得的AOSC-971对雄性大鼠的CYP2E1具有显著的诱导作用（P＜0.05），但对CYP1A2和CYP3A4无显著影响；以甲壳素为基础经分子修饰而得的916对CYP450各主要亚型酶无显著的诱导或抑制作用，也无显著地性别差异。由此可见不同结构特征和相对分子质量的海洋硫酸多糖在对肝微粒体代谢酶亚型的诱导/抑制方面差异较大，其具体的作用机制还有待深入发掘。

本研究选择中医古方（《证治准绳•疡医》、《宣明论方》及《校注妇人良方》等）中海藻–昆布药对的配比和最大处方剂量为低剂量，其8倍剂量为高剂量（分别约合《中国药典》2010年版推荐剂量的7倍和56倍），按体表面积换算法^[21]折算，则低剂量的大鼠等效剂量为10.8 g/(kg∙d)，高剂量的大鼠等效剂量为86.4 g/(kg∙d)。该给药方案接近于临床实际应用，能更好地反应海藻–昆布药对在最大处方剂量及超处方剂量下对机体肝脏CYP450药物代谢酶系的影响。

研究结果显示，以古方药对1∶1配伍的海藻–昆布药对粗多糖在低剂量给药条件下对CYP450各主要亚型酶无显著的诱导或抑制作用，而在高剂量给药条件下，CYP3A4被显著的诱导，CYP1A2和CYP2E1无显著差异。进而推测：海藻–昆布药对粗多糖可能是CYP3A4的潜在诱导剂，在高剂量经口给药下可能会引起有临床意义的CYP3A4亚型酶的诱导现象的发生并阻碍经由该亚型酶特异性代谢的药物的治疗效果。由于CYP3A4亚型酶参与介导了50%～60%临床常用治疗药物的代谢^[22]，这就意味着在与海藻和昆布联合用药时（特别是高剂量下）需密切关注其潜在的药物相互作用影响。

与对照组相比，低剂量和高剂量组大鼠的肝脏在颜色、质地及形态外观上无明显变化，其肝脏系数与对照组相比无统计学差异，说明大鼠肝脏没有表现出明显的充血、肿胀或大片坏死现象，进而可以推测海藻–昆布药对粗多糖对肝组织宏观上的毒性表现并不明显。

病理切片的显微观察表明低剂量和高剂量组大鼠的肝脏均发生了形态学上的改变，低剂量组以肝窦扩张和轻度水肿为主的适应性改变。高剂量组以中度水肿和脂肪样变为主（如图 1中②号所示）的可逆性损伤病变，这可能与药物引起细胞液体和离子内稳态变化的损伤以及改变肝细胞质内脂肪酸含量的分布有关。其中，两例大鼠肝细胞的点状坏死和细胞凋亡增多（如图 1中⑤号所示）可能与药物引起的线粒体功能失调有关^[23]。关于海洋藻类多糖是否具有潜在肝毒性的问题目前仍不清楚，但从本研究结果中可知，其对肝组织的确造成了一定的细胞形态学上的改变，但这些改变可能是肝脏受大剂量药物影响下的适应性变化，肝脏一般能经得起中等程度的片状坏死，在去除病因的若干天后坏死细胞可以被清除，代之以再生细胞，重建正常的结构和功能，其大部分损伤可以逆转^[24]，由于镜下观察结果中未见大片的坏死或凋亡现象发生，可以推测在停药后的预后表现良好。

综上所述，海藻–昆布药对在常规临床剂量下使用有着较高的安全性，其对肝脏CYP450药物代谢酶的影响及肝细胞毒性损伤甚微，但在高剂量特别是超限情况下的使用需对其药物–药物相互作用影响和潜在肝毒性予以高度重视。