安立生坦（ambrisentan，商品名凡瑞克^®）是由美国Gilead Sciences公司开发的一种选择性内皮素ETA受体阻滞剂，其化学名为 (+)-(2S)-2-(4, 6-二甲基嘧啶-2-基) 氧基-3-甲氧基-3, 3-二苯基丙酸，分子式为C₂₂H₂₂N₂O₄，相对分子质量为378.42。安立生坦片于2007年7月获得美国FDA快速批准，口服用于治疗I～III级肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH），以提高活动能力和延缓临床恶化，并授予罕见病用药待遇^{[1, 2]}。

由于药物作用靶点如受体、酶或离子通道等结构上的高度立体特异性，手性药物的不同对映体与靶点的相互作用有所不同，从而产生不同的药理学活性，表现出立体选择性。同样，手性药物进入体内后，与机体内的具有高度立体特异性的代谢酶及血浆蛋白或转运蛋白等相互作用，手性药物的不同异构体在体内也将表现出不同的药动学特征，具有立体专一性^[3]。手性药物对映体在体内的手性环境中易表现出显著的立体选择性，对映体间药动学参 数存在差异^[4]。安立生坦中的R异构体不具有药学活性，其含量高低与安立生坦的疗效和安全性有着密切的关系。因此，严格控制安立生坦中的R异构体的含量尤其重要。本研究通过实验条件的优化，建立了一套可以用来检测安立生坦R异构体的高效液相色谱法。经方法学验证，本方法灵敏度高、专属性强，具有良好的重复性和准确性，可以用来控制安立生坦中R异构体含量，保证用药的安全有效。

图 1 安立生坦构型Fig. 1 Configuration of ambrisentan

Waters e2695-2998PDA高效液相色谱系统（美国Waters公司），Empower色谱工作站（美国Waters公司），ULTRON ES-OVM（150 mm×4.6 mm，5 μm）（日本信和化工株式会社），Sartorius BP211D电子天平（德国赛多里斯公司），AS3120超声波清洗器（奥特赛恩斯仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific），磷酸、磷酸二氢钾（分析纯，天津市天河化学试剂厂），注射用水。

安立生坦R异构体对照品（自制，批号R130501，质量分数99.6%），安立生坦供试品（自制，批号130401、130402、130403）。

以硅胶键合蛋白质型手性色谱柱ULTRON ES-OVM（150 mm×4.6 mm，5 μm）作为固定相；以0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至4.0）-乙腈（80∶20）为流动相；检测波长220 nm；柱温30 ℃；体积流量为1.0 mL/min；进样体积20 μL。

取安立生坦R异构体对照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成2.5 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

取安立生坦供试品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成0.5 mg/mL的溶液，作为供试品溶液。

取安立生坦供试品和R异构体对照品各适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成约含安立生坦0.5 mg/mL和R异构体2.5 μg/mL的溶液，作为分离度溶液。

分别取流动相、安立生坦供试品溶液、安立生坦R异构体对照品溶液和分离度溶液进样。色谱图见图 2。由结果可知，流动相对安立生坦R异构体的测定没有干扰。保留时间为10.908 min的色谱峰为安立生坦峰，15.178 min的色谱峰为R异构体峰，分离度溶液中安立生坦及其R异构体的分离度为7.95。

图 2 流动相（A）、安立生坦（B）、安立生坦R异构体（C）和选择性溶液（D）HPLC图谱 Fig. 2 HPLCof mobile phase (A), ambrisentan (B), R isomer in ambrisentan (C), and selected solution (D)

精密称定安立生坦R异构体适量，加流动相配制成10 μg/mL的溶液，作为线性贮备液。分别精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL溶液，置10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，进样测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。得回归方程Y＝34 814X－3 998.9（r＝0.999 3）。结果表明安立生坦R异构体质量浓度在0.501～4.008 μg/mL与峰面积线性关系良好。

用稀释法将安立生坦R异构体稀释成一定质量浓度的溶液进行测定，当S/N约为10时，该样品质量浓度为最小定量限浓度。结果R异构体的最小定量限为0.501 μg/mL（相当于样品浓度的0.100 2%），以最小定量限溶液稀释3倍确定最低检测限。取最小定量限样品重复进样6针，R异构体峰面积的RSD值为2.98%，说明在定量限水平的测定结果具有一定的精密度和准确性。

配制安立生坦R异构体对照品溶液及6份安立生坦供试品溶液，分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算6份供试品溶液中R异构体质量分数，结果R异构体质量分数的平均值为0.075%，RSD值为2.12%。

配制安立生坦供试品溶液，重复进样6针，记录色谱行为。结果安立生坦主峰峰面积的RSD值为1.32%，R异构体峰面积的RSD值为1.85%。

精密称定安立生坦供试品适量，加流动相配制成0.5 mg/mL的溶液，作为安立生坦贮备液；精密称定R异构体适量，加流动相配制成10 μg/mL的溶液，作为R异构体贮备液。精密量取安立生坦贮备液2 mL，置10 mL量瓶中，分别移加R异构体贮备液0.5、2.0、2.5、3.0 mL，按照20%、80%、100%、120%水平配制，每个浓度平行配制3份，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别进样测定。按外标法以峰面积计算R异构体的总量，扣除安立生坦中R异构体的量，得到对照品的测得值，并与对照品实际加入值进行比较，得到各水平的回收率。结果安立生坦中R异构体的平均回收率为98.62%，RSD值为2.82%（n＝12）。

取安立生坦供试品溶液分别于自然条件下放置0、1、2、4、6、8、24 h后进样测定，记录色谱图，计算得安立生坦峰面积的RSD值为1.02%，R异构体峰面积的RSD值为1.86%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

通过改变不同的流速、波长、调节流动相中的乙腈比例、柱温等色谱参数评估测定条件有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度。按照表 1进行色谱条件的调整，实验结果表明流动相流速、波长、流动相中的乙腈比例、柱温等参数发生微小改变对安立生坦中的R异构体的测定无显著性的影响。

表 1(Table 1)

表 1 耐用性考察中色谱条件参数的变动 Table 1 Parameters changes of chromatographic conditions in durability investigation 色谱条件 规定值 变动范围 流动相流速 1 mL/min 0.9 mL/min、1.1 mL/min 波长 220 nm 215 nm、225 nm 流动相中乙腈 20% 15%、25% 柱温 30 ℃ 25 ℃、35 ℃

表 1 耐用性考察中色谱条件参数的变动 Table 1 Parameters changes of chromatographic conditions in durability investigation

精密称取3批安立生坦供试品样品各适量，用流动相制备成500 μg/mL的溶液，精密称定R异构体对照品适量，用流动相制备成质量浓度约为2.5 μg/mL的对照品溶液，记录色谱图，按外标法计算安立生坦样品中的R异构体质量分数，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 安立生坦中R异构体的测定结果 Table 2 Determination of R isomer in ambrisentan 批号 R异构体/% 130401 0.090 130402 0.093 130403 0.091

表 2 安立生坦中R异构体的测定结果 Table 2 Determination of R isomer in ambrisentan

本试验中采用的ES-OVM手性柱是以卵类黏蛋白作为手性固定相，基于疏水作用和极性相互作用实现药物的手性分离，适用于含有疏水基团的芳香化合物。而其中流动相的pH值决定了溶质和蛋白质的电离程度，也改变了蛋白质分子的三维结构，影响其亲和性和手性选择能力。本试验中，流动相的pH变化对安立生坦及异构体拆分影响很大，是所有试验条件中需要首先考虑的因素。

在手性化合物的分离测定时，通常选用固定相极性较大的手性色谱柱，而流动相通常会选用极性相对较小的正己烷-异丙醇体系。正相色谱系统对液相系统和液相条件均有较高的要求，如流动相中不能含水、流动相选择范围较小，而反相色谱系统对液相系统要求较低，可以采用极性较强的溶剂对测定药物进行优化。经过色谱条件的考察，本方法采用以硅胶键合蛋白质型手性色谱柱ULTRON ES-OVM作为固定相，磷酸二氢钾缓冲液-乙腈系统为流动相，实现了安立生坦与R异构体的分离，达到了分离测定的目的。

本实验考察并建立了一套反相色谱方法测定安立生坦供试品中R异构体的方法，该方法快速、简便，专属性和重复性良好、灵敏度高、测定结果准确。建立的方法可有效控制安立生坦的光学纯度和质量，从而保证临床用药的安全性与有效性。