骨质疏松是以骨强度下降，骨折风险增加为特征的骨骼系统疾病，多发于绝经后妇女、老人和多种慢性疾病患者。随着人类寿命的延长和老龄化社会的到来，骨质疏松的发病率逐年攀升，目前己经跃居世界各种常见病的第7位^[1]。骨质疏松症相当于中医学中的“骨痿”。中医理论认为，肾虚是骨质疏松的主要病机，而肾虚证分型与骨质疏松程度之间存在着一定联系，骨质疏松程度以肾阳虚较为严重^[2]。而目前没有理想的肾阳虚骨质疏松病证结合动物模型，本实验拟建立肾阳虚骨质疏松大鼠模型，为更好地对肾阳虚骨质疏松本质进行探讨，以及对温补肾阳药进行药效评价、新药开发等提供依据。

清洁级雌性SD大鼠48只，体质量（220±20）g，由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（沪）2012-0002。

氢化可的松注射液（天津金耀氨基酸有限公司产品，批号1305131），利血平（上海同田生物技术有限公司产品，批号14010822），甲状腺素片（上海长城药业有限公司产品，批号20130601），水合氯醛（生工生物工程股份有限公司产品，批号ZY1017B4013J），注射用青霉素钠（山东鲁抗医药股份有限公司产品，批号B140709），临用前用生理盐水配成所需浓度；雌二醇（E₂）、睾酮（T）、环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、大鼠三碘甲状腺原氨酸（T₃），四碘甲状腺原氨酸（T₄）酶联免疫试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司产品，批号201401）。

JLGY-1大鼠自发活动测定仪（上海吉星），QDR-4500w型双能X线骨密度测量仪（美国Hologic公司）。

所有大鼠适应性喂养1周后，将大鼠按体质量随机分为3组，分别为实验组16只，去卵巢组16只及假手术组16只。ip 10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，固定动物于手术台上。从下腹部正中逐层切开皮肤、肌层，进入腹腔。除假手术组外，其他各组大鼠行双侧卵巢切除术，即先结扎输卵管与伴行血管，再用弯头手术钳夹分离出“桑葚样”卵巢，结扎，剪除。彻底止血后，逐层缝合。假手术组大鼠切口同实验组，切除一段肠膜后止血缝合，用于对照观察单纯的手术是否对肾虚或骨代谢存在影响。大鼠术后每天均im青霉素4万U/mL，每只注射1 mL/d，连续3 d常规饲养。

第2周开始，实验组每天后肢im氢化可的松注射液（5 mg/mL）20 mg/kg^[3]。假手术组后肢im 0.9%生理盐水4 mL/kg，连续2周。第4周开始，至第3个月，每周给实验组大鼠im氢化可的松注射液2次，以维持肾阳虚状态，假手术组则im生理盐水。

造模期间，根据《中医虚证辨证参考标准》^[4]中肾阳虚诊断标准及大鼠自身特点，通过观察动物的外观表现，如毛发稀疏度及色泽、精神状况、活动状态、眼神（眼球运动）、饮食、呼吸、睡眠、排便状况等，来判断其与肾阳虚的符合程度，同时与假手术组大鼠进行对比，确定模型是否成功。

每2周取各组大鼠称1次体质量，测量时间为9︰00—10︰00时。在给药造模3个月后，采用多功能大鼠自主活动记录仪测定各组大鼠自发活动次数，各组尽量平行测定，每只大鼠先适应5 min，再测定10 min内的自主活动次数。

给药造模2周后，随机抽取实验组、去卵巢组，假手术组各6只大鼠，通过腹主动脉采血5 mL，将血液静置2 h后，5 000 r/min离心15 min，分离血清，以酶联免疫法测定血中cAMP、cGMP的量，3个月后，同法取各组大鼠血清，测定血清中E₂、T、ACTH、cAMP、cGMP、T₃、T₄的水平。采血后，取大鼠肾上腺、胸腺、甲状腺，立即称取质量，并计算每只大鼠所取组织质量同体质量比值，为脏器系数。

3个月后，取各组大鼠右侧股骨，用生理盐水冲洗后，用生理盐水浸渍的医用纱布包裹，再用预先准备的锡纸包裹，应用双能X线骨密度仪对大鼠离体股骨上骨密度及骨矿含量进行检测。

采用SPSS 10.0软件处理所得数据，选用ONE-Way ANOVA进行统计分析，数据以x±s表示。。

给药造模2周后，实验组大鼠出现毛发竖立、无光泽、卷缩弓背、精神萎顿、怠倦嗜睡、畏寒喜暖、小便清长、抓取时抵抗力减弱等一系列肾阳虚的表现。第8周开始，去卵巢组大鼠也出现了畏寒倦卧、精神萎靡、反应迟钝、大便略稀等肾阳虚症状，但较轻微。相比之下，造模期间，假手术组大鼠毛发光滑，行动活泼，精神状态较好，反应敏捷，大小便均正常。

造模期间大鼠的体质量变化见表 1。实验开始时，各组大鼠体质量无统计学差异，说明分组时遵守组间均衡一致的原则。给药造模后，实验组大鼠的体质量呈缓慢增长的趋势，从第4周开始，其体质量与去卵巢组、假手术组大鼠相比具有显著差异。从第8周开始，去卵巢组与假手术组体质量相比差异显著。在自发活动方面，实验组大鼠的活动度明显低于假手术组和去卵巢组，去卵巢组大鼠的活动度也低于假手术组，但没有统计学差异（图 1）。

表 1(Table 1)

表 1 造模期间各组大鼠体质量比较(x±s) Table 1 Comparison of body weight of rats in each group during modeling(x±s) 组 别 体质量/g 第0周(n=16) 第2周(n=16) 第4周(n=10) 第6周(n=10) 第8周(n=10) 第10周(n=10) 假手术 233.67±4.73 253.00±6.24 269.00±9.54 303.00±4.58 331.33±5.51 349.60±9.50 去卵巢 241.33±7.55 259.50±9.09 274.00±10.35 292.00±9.63 311.00±9.54 327.67±4.93 实验 239.00±8.65 252.67±11.66 250.17±8.18△△ 267.17±8.75**△△ 281.83±8.73**△△ 305.00±11.10**△△ 第0周指手术前一周；与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与去卵巢组比较：△△P＜0.01 Week 0 refers to the week before operation; P < 0.05, **P < 0.01 vs sham operation group; △△P < 0.01 vsovariectomy group

表 1 造模期间各组大鼠体质量比较(x±s) Table 1 Comparison of body weight of rats in each group during modeling(x±s)

图 1 各组大鼠自发活动次数比较(x±s,n=10)Fig. 1 Comparison of locomotor activity of rats in each group(x±s,n=10)

给药造模2周后，实验组、去卵巢组、假手术组大鼠血清cAMP及cGMP水平见表 2。与假手术组相比，实验组大鼠的cAMP降低，cGMP升高，cAMP/cGMP显著降低，说明肾阳虚模型基本建立。3个月后，各组大鼠的血清cAMP、cGMP、E₂、T、T₃、T₄的测定结果见表 3。与假手术组和去卵巢组大鼠相比，实验组大鼠的cAMP下降，cGMP上升，cAMP/cGMP比值明显下降，符合肾阳虚的指征。同时，该组大鼠血清E₂、T₃、T₄、ACTH水平均显著低于假手术组，T值较去卵巢组升高，但与假手术组相比没有统计学差异。去卵巢组大鼠血清中cAMP、T₃、T₄均较假手术组大鼠显著下降，血清cGMP、E₂、T和ACTH水平则未见明显差异。

表 2(Table 2)

表 2 造模2周后大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP(x±s,n=6) Table 2 Comparison on cAMP, cGMP, and cAMP/cGMP levels in serum of rats in each group after two weeks of modeling(x±s,n=6) 组 别 cAMP/(nmol∙L−1) cGMP/(nmol∙L−1) cAMP/cGMP 假手术 8.35±0.45 21.05±1.42 0.39±0.04 去卵巢 8.42±0.44 22.82±1.63 0.37±0.01 实验 7.10±0.26 30.94±2.17** 0.23±0.02** 与假手术组比较：**P＜0.01 **P < 0.01 vs sham operation group

表 2 造模2周后大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP(x±s,n=6) Table 2 Comparison on cAMP, cGMP, and cAMP/cGMP levels in serum of rats in each group after two weeks of modeling(x±s,n=6)

表 3(Table 3)

表 3 3个月后各组大鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、E2、T、T3、T4、ACTH比较(x±s,n=10) Table 3 Comparison on cAMP, cGMP, cAMP/cGMP, E2, T, T3, T4, and ACTH levels in serum of rats in each group three month later(x±s,n=10) 组 别 cAMP/(nmol∙L−1) cGMP/(nmol∙L−1) cAMP/cGMP E2/(ng∙L−1) T/(ng∙mL−1) T3/(ng∙mL−1) T4/(nmol∙L−1) ACTH/(ng∙L−1) 假手术 8.03±0.44 18.98±1.55 0.43±0.06 57.56±1.69 2.16±0.18 63.67±7.05 78.92±1.26 65.79±3.70 去卵巢 7.37±0.32 18.78±1.24 0.39±0.04 55.30±1.83 1.81±0.24 48.02±7.85 68.61±5.03 69.60±3.58 实验 6.74±0.47△ 20.31±1.46 0.33±0.03△ 49.71±4.08△ 2.28±0.22△ 42.1±4.82** 69.95±4.33 54.03±3.38**△△ 与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与去卵巢组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01 *P < 0.05, **P < 0.01 vs sham operation group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vsovariectomy group

表 3 3个月后各组大鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、E2、T、T3、T4、ACTH比较 (x±s,n=10) Table 3 Comparison on cAMP, cGMP, cAMP/cGMP, E2, T, T3, T4, and ACTH levels in serum of rats in each group three month later(x±s,n=10)

实验组、去卵巢组大鼠的肾上腺系数及甲状腺系数均显著低于假手术组相应系数，胸腺系数亦有降低的趋势，但没有显著性差异。实验组与去卵巢组大鼠比较差异无统计学意义。见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 各组大鼠的脏器系数比较(x±s,n=10) Table 4 Comparison on organ coefficient of rats in each group(x±s,n=10) 组 别 肾上腺系数 胸腺系数 甲状腺系数 假手术 0.027 4±0.004 4 0.053 0±0.015 0 0.006 7±0.000 6 去卵巢 0.019 7±0.005 4 0.049 3±0.028 2 0.004 1±0.001 2** 实验 0.014 9±0.002 4** 0.045 4±0.009 6 0.003 9±0.000 9** 与假手术组比较;P＜0.05，**P＜0.01 *P < 0.05, **P < 0.01 vs sham operation group

表 4 各组大鼠的脏器系数比较(x±s,n=10) Table 4 Comparison on organ coefficient of rats in each group(x±s,n=10)

3个月造模结束后，实验组大鼠的骨密度和骨矿含量均显著低于假手术组，且骨矿含量低于去卵巢组，见表 5。

表 5(Table 5)

表 5 各组大鼠骨密度及骨矿含量比较(x±s,n=10) Table 5 Comparison on BMD and BMC of rats in each group(x±s,n=10) 组 别 骨密度/(g∙cm−2) 骨矿/g 假手术 0.175 3±0.005 7 1.643 0±0.337 1 去卵巢 0.141 8±0.014 3** 1.132 0±0.180 7 实验 0.141 8±0.013 4** 1.066 0±0.147 6△ 与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与去卵巢组比较：△P＜0.05 *P<0.05, **P<0.01 vs Sham operation group; △P<0.05 vs ovariectomized group

表 5 各组大鼠骨密度及骨矿含量比较(x±s,n=10) Table 5 Comparison on BMD and BMC of rats in each group(x±s,n=10)

骨质疏松症是老年人，尤其是绝经妇女最常见的一种退行性骨代谢性疾病。研究表明，绝经后骨质疏松症属于肾虚者高达89.92%^[5]。临床实践中，骨质疏松症患者表现为腰膝酸软、畏寒肢冷等肾阳虚证者占大多数^[6]。然而，目前却没有理想的肾阳虚骨质疏松病证结合动物模型。为了进一步研究肾阳虚骨质疏松证本质及相关药物研发，构建一个理想的病证结合动物模型十分必要。

用一定量的外源性糖皮质激素（氢化可的松）使垂体前叶的ACTH释放受到抑制，从而使肾上腺皮质分泌类固醇激素减少，动物出现一系列的“耗竭”现象，如毛发干枯、畏寒喜暖、大便稀溏、小便清长、卷缩弓背、怠倦嗜睡、自主活动次数减少等肾阳虚症状^{[7, 8]}，是较为经典的肾阳虚证动物模型。去势模型包括卵巢切除术和睾丸切除术两种方法，在多种动物上可观察到明显的性激素水平下降，骨矿含量降低，骨小梁稀疏变细等改变，与临床骨质疏松症状相符，并具有手术简单，重复性好，周期短等特点，是目前复制绝经后及老年性的骨质疏松的经典方法^[9]。临床证实，长期大剂量运用糖皮质激素亦可引起内分泌系统功能紊乱及骨质疏松等严重不良反应。本课题组前期试图采用im氢化可的松的方法建立肾阳虚骨质疏松大鼠模型。结果发现，每天后肢im氢化可的松注射液（5 mg/mL）20 mg/kg，连续给药4周后，大鼠死亡数量过半，剩余动物状态极度虚弱。检测骨密度与骨矿含量，与正常组并无明显差异，说明该造模方法不可行。采用连续2周每天后肢im氢化可的松注射液（剂量同上）造成阳虚后，第3周开始，每周给药2次，持续3个月，动物未见死亡。3个月后，与对照组相比，第2组大鼠血清cAMP、cAMP/cGMP显著下降，骨密度和骨矿含量与正常组比较未见显著差异。说明减少给药频次后，糖皮质激素可维持大鼠的阳虚症状，但不足以造成骨质疏松。因而本实验试图采用去势联合im氢化可的松的方法建立肾阳虚骨质疏松的病证结合动物模型。

检测指标的选择和测定：下丘脑-垂体-靶腺轴（肾上腺轴、胸腺轴、甲状腺轴、性腺轴）不同环节、不同程度的功能紊乱是肾阳虚证的主要病理环节^{[10, 11]}，反映这几个轴功能改变的指标是肾阳虚证较为特异的指标^[12]。ACTH水平、肾上腺系数降低反映了下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的紊乱或抑制^{[13, 14]}。胸腺系数降低反映了下丘脑-垂体-胸腺轴的功能抑制；血清T₃、T₄水平，甲状腺系数的降低反映了下丘脑-垂体-甲状腺轴不同程度的功能紊乱^{[16, 17]}；E₂、T则体现了下丘脑-垂体-性腺轴功能的改变^[18]。

另外，cAMP、cGMP是机体内第二信使物质，是调节生理功能、物质代谢和细胞增殖、分化的重要因子^[19]。cAMP的配基包括多肽类激素，对机体肾上腺皮质激素、甲状腺激素等内分泌激素有一定调节作用，它们之间的改变具有一定相关性，cAMP、cGMP及其比值是反应肾阳虚或阴虚的特异指标。阳虚时cAMP降低，cGMP升高，cAMP/cGMP比值降低^[15]。骨密度、骨矿含量等是评判骨质疏松动物模型复制成功与否的主要指标^[20]。

实验结果表明，肌注氢化可的松2周后，实验组大鼠出现毛发枯槁、卷缩弓背、怠倦嗜睡、畏寒喜暖、小便清长、消瘦、自发活动次数减少等一系列阳虚症状，与假手术组大鼠形成对比，按照《中医虚证辨证参考标准》^[4]中肾阳虚诊断标准，符合要求。同时，实验组大鼠cAMP降低、cGMP升高、cAMP/cGMP比值明显降低，提示该模型为肾阳虚模型。3个月后，与假手术组相比，实验组大鼠cAMP、cAMP/cGMP、E₂、T₃、T₄、ACTH均显著下降，肾上腺系数和甲状腺系数亦显著降低。其中，cAMP、cAMP/cGMP、E₂、ACTH水平与去卵巢组大鼠相比差异显著。骨密度和骨矿含量显著降低，且骨矿含量较去卵巢组低，说明肾虚在一定程度上加速了骨丢失。而去卵巢组虽然在造模后期呈现出一定的阳虚症状，但是在自发活动次数，cAMP/cGMP、E₂、T、ACTH等方面的指标与假手术组相比并无显著差异。

综上所述，去势联合im氢化可的松是建立肾阳虚骨质疏松病证结合动物模型较为有效的方法。