脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占所有原发性中枢神经系统肿瘤的32%，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌（位列第3位），是35岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因。脑胶质瘤中一半以上是恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform，GBM）^[1]。GBM是Ⅳ级脑肿瘤，年发病率为5×10⁻⁶～8×10⁻⁶，具有生长迅速、侵袭性强等特性，使得手术彻底切除困难，极易复发^{[1, 2]}。原发的GBM多发生于55岁以上的中老年患者，而继发的多发生于年龄小于55岁的患者，是由低级别胶质瘤发展而来，占GBM的5%～10%^[3]。目前对GBM的治疗采用手术和放化疗的综合治疗方式。临床实践证明，成功手术后的有效化疗是目前治疗恶性脑胶质瘤的有效手段之一，化疗可以明确提高恶性脑胶质瘤患者的生存率和生存时间。

替莫唑胺（TMZ）是第二代口服烷化剂，易通过血脑屏障，是临床治疗恶性脑胶质细胞瘤的标准一线化疗药^[4]。替莫唑胺主要攻击肿瘤细胞DNA，造成DNA烷基化损伤，主要发生在N³、N⁷、O⁶位鸟嘌呤和O³位的腺嘌呤处，进而形成DNA交联，导致癌细胞死亡^[5]。临床研究表明，TMZ对人恶性脑胶质瘤的有效率在45%左右^[6]。GBM对TMZ的耐药性是化疗失败的主要原因，即使采用了最为积极的治疗手段，GBM患者中位生存期仍然少于15 个月。Weller等^[7]对TMZ在胶质瘤细胞中获得性耐药分子机制进行了探讨，发现TMZ的耐药不是单一因素影响，主要包括肿瘤干细胞及其微环境、肿瘤细胞对化疗药物的应激反应、药物向肿瘤组织中的渗透性及各种DNA损伤修复途径介导的耐药。本文就近年来对TMZ耐药的有关因素及其分子靶点的研究进行综述。

1 药物向肿瘤组织中的渗透性介导的耐药

渗透作用影响抗癌药物的作用主要体现在抗癌药物向肿瘤组织的渗透性差，导致药物在肿瘤内部不能达到有效浓度，从而导致化疗失败。

传统的化疗药物具有抗血管生成的特性，通过破坏血管内皮细胞或抑制血管内皮生长因子的表达抑制肿瘤血管生成，反过来也会限制药物成功进入血管^[8]。Kato等^[9]探讨了TMZ对MCF-7异种移植实体瘤及体外MCF-7细胞作用的比较，发现反复使用TMZ会使血管通透性-表面积降低，同时检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）mRNA的表达情况。结果显示在体内作用TMZ后MGMT mRNA的表达没有明显变化；但是，在体外培养的MCF-7细胞中，高于50 μg/mL TMZ处理后能够诱导MGMT mRNA表达。这种MGMT的不同表达形式可能与TMZ在瘤内的浓度低于体外有关。

这种现象说明抗癌药物的耐药与管通透性-表面积的降低有关，从而减少药物向肿瘤细胞的渗透，同时推测在肿瘤内部MGMT不是导致耐药的最主要原因^[10]。

2 GBM干细胞和复杂的血管系统介导的耐药 2.1 多形性脑胶质瘤干细胞能够分化成胶质瘤内皮细胞

GBM具有复杂的血管系统等特性，这些复杂的血管系统是由高度复制的血管内皮细胞和紊乱的血管组成^[11]。研究表明，造成GBM这种复杂血管的特性是由于GBM胶质瘤干细胞能够分化成内皮细胞，缺氧条件甚至能够促进这种分化。分化的内皮细胞一部分具有运输液体的功能，一部分将会导致GBM异常血管的形成^[12]。Ricci-Vitiani等^[13]发现抑制GBM干细胞分化成内皮细胞可以减少肿瘤的生长，同时能够消除血管球，这表明胶质瘤内皮细胞（GECs）能够促进肿瘤的生长和血管系统的发展。此外，GECs接受放化疗时发生衰老而不是凋亡，说明GECs对目前的标准治疗具有耐药性。因此，GECs也许能够成为治疗的新靶点，通过抑制多形性脑胶质瘤干细胞（CSCs）向GECs的分化，能偶减少肿瘤血管的生成从而减慢肿瘤的生长。 2.2 GBM干细胞与其微环境

肿瘤的生长需要血管向不断复制扩增的肿瘤细胞提供氧和营养物质，同时排出有害的代谢物质。如果肿瘤过大，它将缺少足够的氧和营养物质，为了缓解无氧条件，细胞分泌一种能够促进血管生成的因子，即血管内皮生长因子（VEGF），它能够促使血管增殖、迁移，最终形成新的血管。而GBM的异常血管系统会促使多形性胶质细胞瘤神经干细胞本身分泌VEGF和基因细胞来源因子1（SDF1），从而促进肿瘤血管的生成；同时，胶质瘤微血管系统内皮细胞（tMVECs）能够保护CSCs免受化疗药物的损伤。Borovski等^[14]认为tMVECs可能参与MGMT的表达，增加DNA修复途径从而保护干细胞免受化疗的损害。 3 肿瘤细胞引起的内质网凋亡途径介导的耐药

内质网应激反应（ERSR）是通过多种病理，如低氧、营养缺失以及肿瘤的产生等条件所引起的一种自我保护方式。通过激活非折叠蛋白反应（UPR）可以维持细胞的正常功能并使之存活；但是如果损伤较严重，稳定的内环境不能及时恢复，ERSR就会引起细胞凋亡，信号由促生存向促凋亡转换。

胶质瘤细胞周围经常处于低氧状态使其经常处于低应激状态，这种由ERSR引起的保护机制会长期被激活，也同时保护了肿瘤细胞免受来自于化疗药物的损伤从而导致耐药。所以近年来经常有研究将ERSR做为治疗GBM的目标。Sun等^[15]研究发现脯氨酰羟化酶β多肽（P4HB）过表达与TMZ的IC₅₀增加有关；同时在临床上发现获得性耐药的肿瘤标本中P4HB表达相对增加，通过siRNA敲除或杆菌肽抑制P4HB可以增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性；相反，使P4HB表达增高也会导致其在体外对TMZ耐药。所以，P4HB能够保护胶质瘤细胞，使其对替莫唑胺耐药，因此降低P4HB的表达能够提高胶质瘤细胞对化疗的敏感性^[16]。 4 肿瘤细胞发生自噬对耐药的影响

自噬，即大分子自发吞噬作用，是细胞遇到压力或饥饿等条件时自发的降解，循环利用细胞内容物来为细胞提供一种能源。在自噬过程中，一种名为自噬体的双膜细胞质囊泡包裹大分子甚至整个细胞器。自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，降解细胞内容物，所以自噬是细胞维持内环境稳态必不可少的^{[17, 18]}。

临床应用的TMZ剂量能够导致细胞发生自噬，而不是凋亡。用巴弗洛霉素A抑制自噬，能够激活caspase-3继而发生凋亡，说明自噬能够使胶质瘤细胞逃避死亡。TMZ导致的自噬是由于TMZ引起的O⁶-MeG损伤。用siRNA敲除MSH2-MSH6复合体能够取消自噬，说明自噬的发生需要错配修复（mismatch repair，MMR）。用TMZ处理某些胶质瘤细胞时发现自噬先于凋亡发生，在一些研究中显示抑制自噬不仅能增加凋亡，还能使凋亡发生得更早，因此自噬能够使胶质瘤细胞免除TMZ造成的死亡^[19]。

由于放疗也是治疗GBM的一个重要部分，有研究表明自噬能够增加细胞对放疗的敏感性，从而增加细胞死亡^[20]。说明自噬对于耐药的作用是比较复杂的，通常取决于细胞种类和具体的治疗方法。

5 DNA修复途径介导的耐药 5.1 O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶

替莫唑胺可引起DNA上O⁶-烷基鸟嘌呤发生甲基化，虽然O⁶-MeG仅占碱基损伤的6%，但它干扰DNA复制的程度最严重、毒性最大。MGMT可将TMZ导致的O⁶-MeG加合物转移到自身半胱氨酸残基上，避免DNA发生交联、断裂，使DNA得以修复，从而导致肿瘤对烷化剂的耐药，同时自身不可逆的失活，即“自杀式”修复机制。这种机制表明O⁶-烷基鸟嘌呤加合物移除的数量是由MGMT分子在细胞中的数量及合成速度决定的^[21]。

目前研究认为，MGMT是胶质瘤细胞对TMZ耐药的主要机制之一。Wiewrodt等^[22]比较新诊断的与接受TMZ化疗后复发的患者体内MGMT的活性，发现后者中MGMT活性明显增高。MGMT与脑肿瘤患者的生存率呈负相关。因此，目前认为有效的消耗MGMT蛋白可能是提高替莫唑胺疗效的有效途径。

近来，乙醛脱氢酶（ALDH）1A1可作为胶质瘤干细胞新的标示，在多种肿瘤（乳腺癌、大肠癌及前列腺癌）中均发现ALDH1A1的表达与临床预后效果低有关。ALDH1A1是一种新的与TMZ耐药有关的酶，ALDH1A1高表达者对TMZ敏感性低，这种现象在MGMT表达为阳性细胞中更为明显。ALDH1A1和MGMT都为阳性的细胞（T98G）对TMZ的敏感性最低；ALDH1A1和MGMT都为阴性的细胞（LN229）对TMZ最为敏感。抑制或敲除ALDH1A1可增加MGMT阳性的TMZ耐药细胞株的细胞毒性作用、减少细胞集落的形成以及延长细胞G₂/M期。这表明，ALDH1A1在介导TMZ耐药过程中起重要作用，可作为临床诊断治疗GBM的可靠指标^[23]。 5.2 错配修复

错配修复系统是切除和修复DNA重组和复制过程中出现的碱基错配。如果MMR功能缺陷将影响细胞识别DNA损伤和激活凋亡的能力，从而使肿瘤细胞对一些化疗药物产生耐药。

研究表明，罗米曲松（lomeguatrib）可使肿瘤细胞中的MGMT活性下降95%，但对MMR功能缺失的肿瘤细胞不能增加其对TMZ的敏感性，这是因为O⁶-MeG损伤处会与胸腺嘧啶碱基错误配对，这种错配会被MMR系统识别，切除胸腺嘧啶残基，在MGMT缺乏的情况下，O⁶-MeG仍然存在，胸腺嘧啶会被重新插入O⁶-MeG的对位，这种无效的循环修复系统会激活ATR和Chk1，导致双链断裂，最终导致细胞发生凋亡。缺乏MMR的细胞不会经历错配这个过程，DNA复制将会继续，则细胞周期不会发生停滞，也不会有细胞凋亡的发生。所以，即使MGMT的活性降低，但是MMR的缺失也会导致耐药^[24]。

如果MMR基因发生突变使参与MMR的蛋白失去活性，TMZ造成的O⁶-meG:T错配未被发现，会增加替莫唑胺的耐药性。MMR基因突变造成功能丧失主要由于hMLH1基因启动子甲基化造成的，hMLH1和hMSH2缺失占MMR系统缺失的大部分，因此在MMR中起着重要的作用，可作为烷化剂耐受的分子指标^[24]。 5.3 碱基切除修复

细胞中有能够识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能够特异性地切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，称为AP位点。DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链，这一过程即为碱基切除修复（base excision repair，BER）。

Trivedi等^[25]对替莫唑胺介导的细胞中BER的作用进行了研究，认为替莫唑胺引起的DNA损伤超过80%是作用在N甲基化部位的碱基，这些部位的甲基化是由DNA转葡萄糖基酶识别的，而不是MGMT。所以，BER途径是导致替莫唑胺耐药的重要途径，其作用程度取决于BER基因的表达及活性。 5.4 DNA单链断裂修复

多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）能够识别单链断裂并启动修复过程。PARP利用NAD⁺作为底物催化ADP-核糖聚合链生成，修饰受体蛋白活性，传递DNA损伤信息^{[26, 27]}。PARP不仅可以调节DNA单链断裂修复（SSB）修复，同时也能够调节BER途径，使得PARP成为调节DNA修复系统的靶点。临床前试验将PARP抑制剂（如ABT-888）与替莫唑胺联用能够明显增加GBM对TMZ的敏感性^[28]。ABT-888是一种能够抑制PARP的新型苯并咪唑类化合物，由于能够良好的透过血脑屏障，目前与替莫唑胺联合治疗GBM已经进入Ⅰ期临床^[29]。此外，PARP抑制剂能够恢复MMR缺失的细胞对替莫唑胺的敏感性^[30]。体外实验发现ABT-888能够增加未用TMZ处理过的胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，对已获得耐药的细胞不能增加其敏感性，所以TMZ和PARP抑制剂联用对新诊断的胶质瘤患者疗效 更好^[31]。 5.5 DNA双链断裂修复（DSB）

DNA双链断裂主要激活同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两条修复通路。NHEJ途径中Ku70/80蛋白识别断裂的双链，使其与蛋白激酶DNA-PKcs连接，启动XRCC4和DNA连接酶Ⅳ达到修复效果。NHEJ能够直接修复DSB，不依赖细胞周期，是GBM在放疗过程中修复的重要途径^[32]。HR修复的双链断裂过程需要姐妹染色单体作为模板，因此HR只能在细胞周期的S和G₂期进行。参与HR调控的分子有很多，如ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、P53、CHK1等。在体外肿瘤模型中，NBS1、Rad51、BRCA2等信号蛋白参与TMZ敏感性的调控。此外，一些研究发现ATM、ATR、和MRN蛋白能够延长TMZ导致的G₂期停留，增加TMZ的细胞毒性作用，说明这些分子可能成为克服TMZ耐药的靶点^[33]。 6 结语

脑胶质瘤对替莫唑胺的耐药不是单一因素影响的。近来对TMZ耐药的研究主要集中在MGMT、MMR和BER修复途径。SSB和DSB修复途径在TMZ耐药中的作用也将受到重视。

首先，每一种DNA修复途径不是独自发挥功能，而是与其他途径相互干扰、相互影响的，其功能的发挥是由DNA损伤的程度决定的。因此，逐步分析这种复杂的DNA修复途径甚至可能发现化疗耐药的新靶点。

其次，建立有用的分子标记来评估DNA修复的状态有望开发出针对修复途径的有效治疗方法。通过对相关的分子标记进一步研究，有望实现个体化治疗。个体化化疗与用药可以减少药物的耐受、增加疗效，针对患者的基因型检测可以选择更加有效的药物，从而提高化疗的有效性。

再次，替莫唑胺的耐药与肿瘤细胞本身也有其相关性，细胞受到药物刺激时能够引起自身的内质网应激反应，使肿瘤细胞免于化疗药物的损伤。同时，脑胶质瘤干细胞能够分化成内皮细胞，促进GBM异常血管的生成，并且脑胶质瘤干细胞群能够激活DNA修复途径，是化疗耐药的重要因素。此外，DNA的修复途径是由TMZ导致DNA损伤所引起的，但在DNA发生破坏之前仍有很多因素影响TMZ的疗效。如，TMZ药物本身进入肿瘤内部的浓度通常不能达到有效的治疗浓度。

另外，临床TMZ的用量能够引起细胞发生自噬，从而逃避死亡，这也是TMZ耐药的又一影响因素。肿瘤对化疗的耐药不仅与肿瘤自身有关，同时肿瘤的微环境也对耐药有很大的影响。所以，对TMZ耐药的进一步研究需要考虑这些综合因素。

目前一些化学药物研究者正在合成一些新的替莫唑胺类似物，有望能够比替莫唑胺更加有效的治疗胶质瘤，可以通过这种方法使得药物本身更多的消耗MGMT蛋白，也可以合成能够避开形成DNA加合物而发挥作用的新药。也可以针对避免低级肿瘤向多形性脑胶质瘤转向的某些靶点设计一些抑制剂。同时，发现导致肿瘤复发的某些机制靶点，可以为将来提高生存率开发一些更好的治疗方案。