胚胎干细胞（embryonic stem cells）是从早期胚胎或原始性腺分离后，能在体外长期传代培养并保持高度未分化的全能细胞系^[1]。胚胎干细胞最重要的特点是具有无限分化潜能，即可分化为各种体细胞并形成组织和器官^[2]。通过对胚胎干细胞的深入研究，有学者期望建立胚胎干细胞体外分化的模型，用于药物临床前研究和新药的筛选。该模型可模拟体内胚胎发育过程，替代生殖毒性实验，操作便捷的同时还避免了伦理道德问题。该技术的成功实施将极大地推动新药研发以及药物评价的进程。

1998年，人的胚胎干细胞被成功分离并克隆^[3]。随即就有学者运用各种物质体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞和心肌细胞。体外诱导干细胞的物质很多，其中就包括化学药物和部分中药提取物。体外分化可以通过加入化合物、基因修饰和共培养的方式诱导胚胎干细胞实现。现就胚胎干细胞体外分化为心肌细胞、肝细胞的研究进展做一综述，以期为新药研发与治疗靶点发现提供依据。 1 拟胚体途径诱导分化

拟胚体（embryoid body）是胚胎干细胞在体外重力条件下自发聚集而形成类似早期胚胎的球体结构，它模拟了胚胎在体内早期发育中组织细胞的分化，常作为胚胎发育理想的体外模型^[4]。因此，大量胚胎干细胞的分化实验都是通过拟胚体来实现的，这也是目前一个非常成熟的方法，一般分为细胞因子或细胞外基质诱导分化、遗传修饰后诱导分化、化合物诱导分化等3个方面。 1.1 细胞因子或细胞外基质诱导分化

在诱导过程中，加入与细胞分化发育相关的细胞因子优化诱导条件，诱导胚胎干细胞向目标细胞进一步分化。Ao等^[5]研究表明一种针对dorsomorphin的第二代小分子骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）抑制剂dorsomorphin homologue 1（DMH1）能有效地诱导胚胎干细胞形成跳动的心肌细胞。Gouon-Evans等^[6]研究并证实了骨形态发生蛋白-4（BMP-4）对于小鼠胚胎内胚层向肝系分化具有重要作用。Nakanishi等^[7]研究证明前列腺雄激素抑制信号-1（prostatic androgen repressed message-1，PARM-1），一种内质网分子，能够提高胚胎干细胞分化为心肌细胞的转化率，但没有改变中胚层标记的表达。

由细胞外基质构成的三维支架可以模拟体内分化的微环境，诱导胚胎干细胞向心肌细胞、肝细胞分化。Higuchi等^[8]研究发现在由心脏细胞外基质培养的胚胎干细胞心脏肌球蛋白重链和心脏肌钙蛋白Ⅰ的表达量高于肝脏细胞外基质，蛋白表达量也高于肝脏细胞外基质。Eremeev等^[9]报道胚胎干细胞在含有外源性生长因子3D胶原培养系统中能够向肝细胞分化，并且该分化细胞能够表达各类肝细胞所具有的标志物。 1.2 遗传修饰后诱导分化

遗传修饰法是一种新发展的胚胎干细胞分化方法。它是通过在培养系统内或细胞内转入某些基因来促进胚胎干细胞向目标细胞分化，该方法关键在于选择合适的基因和筛选标记，同时其安全性也需要注意。Xiang等^[10]研究证明，由慢病毒介导Wnt11转入骨骼肌源性干细胞（Skeletal muscle-derived stem cells，SMDSCs），能够显著提高MDSCs分化为心肌细胞的效率，诱导的心肌细胞有更好的活性，将来有可能用于心肌梗死的治疗。2002年，Kanda等^[11]研究证明：强制表达肝细胞核因子3β的胚胎干细胞在含有成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor，FGF2）等诱导剂的培养系统中能诱导分化为肝细胞。 1.3 化合物诱导分化

已有研究显示丁酸钠可通过影响组蛋白去乙酰化酶抑制剂的活性介导多种胚胎干细胞分化^{[12, 13]}。Oh等^[14]研究证明一些β转角小分子拟肽物，如CW209E，能够提高胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化效率。之前的研究发现，DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化在胚胎干细胞分化过程中有一定作用，如5-氮胞苷可诱导间充质细胞分化为心肌细胞^[15]，而5-氮胞苷-2′-脱氧胞苷和曲古抑菌素（trichostatin）A则可以影响脂肪细胞的命运^[16]。 2 细胞单层诱导分化

目前对于胚胎干细胞分化研究，大多数研究者都采用了拟胚体的方法，该方法充分利用了拟胚体在胚胎早期分化中的作用，为进一步的定向分化奠定了基础^{[17, 18, 19]}。尽管拟胚体的形成有利于后续的定向分化，但拟胚体的分化具有不确定性，这样就影响诱导分化率。研究还发现拟胚体并不是胚胎干细胞分化的必经阶段。随着对胚胎发育过程的深入研究，对早期胚胎分化的分子机制逐步掌握，胚胎干细胞单层定向诱导分化己具备可行性，而且该方法操作简单，只要诱导分化条件合适就会获得非常高的分化率，因而逐渐成为当前胚胎干细胞细胞分化研究的重要方式。 2.1 细胞因子或化合物诱导分化

Dong等^[20]利用丙戊酸和细胞因子（肝细胞生长因子、表皮生长因子和胰岛素）先将小鼠胚胎干细胞分化为肝祖细胞，再继续诱导为有功能的成熟肝细胞。Lian等^[21]研究发现胰岛素能够抑制单层人胚胎干细胞向心肌细胞分化，但是当加入小分子经典Wnt信号调节剂后，胰岛素不能抑制单层人胚胎干细胞向心肌细胞的分化。 2.2 共培养系统诱导分化

共培养系统诱导方法是通过共培养的方式诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞、肝细胞的方法。Yue等^[22]研究表明骨髓基质干细胞在与拟胚体共培养的过程中，能够诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化，同时能够提高BMP-4和视黄酸的诱导作用。Soto-Gutierrez等^[23]将小鼠胚胎干细胞与人肝脏非实质细胞共培养，并添加成纤维细胞生长因子2、活化素-A（activin-A）及肝细胞生长因子，发现诱导细胞可以表达肝特异性基因，并分泌血清白蛋白，形成了功能性肝细胞。将其灌输入人工肝，可以缓解肝切除所致的肝损伤，与原代肝细胞作为种子细胞的人工肝比较具有相似的功能。

有研究表明在将小鼠与受损肝细胞和胚胎干细胞共培养的过程中，胚胎干细胞能够抑制肝细胞的凋亡，促进肝细胞的增殖，而且胚胎干细胞在肝细胞存在的条件下分化为肝细胞，参与受损肝细胞的修复^[24]。欧念文等^[25]发现利用心肌干细胞（cardiac stem cells，CSCs）与心肌细胞共同培养可以促进CSCs向心肌细胞分化。有报道表明将胚胎肝细胞与大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体外共同培养，使得大鼠骨髓MSCs分化为类肝细胞^[26]。 3 结语

本文阐述了胚胎干细胞在体外诱导分化为心肌细胞和肝细胞的主要方法。随着研究的深入，已经有研究者在体内分化出心肌细胞和肝细胞^{[27, 28, 29]}。这对于胚胎干细胞诱导心肌细胞和肝细胞，并将其应用于临床又迈进了一大步。

在药理学方面，有学者研究在胚胎干细胞分化为体细胞的过程中，向培养系统内加入药物观察对胚胎干细胞分化的影响，以期建立体外研究模型。该模型可用于新药的临床前研究，用于前期的药物筛选。该模型还可模仿体内胚胎发育过程，作为生殖毒性的替代实验。这样会更加方便，且成本较体内研究低，同时避免了伦理道德问题。

由于胚胎干细胞面临的伦理学困境和免疫排斥问题限制了其应用，而一种类似胚胎干细胞的特殊细胞的发现，给解决这个问题带来了一线曙光，这就是体细胞获得的诱导性多能干细胞。这种细胞在自然界是不存在的，但是它具有和胚胎干细胞几乎相同的生物学属性，这为医学新时代揭开了新的一页^{[30, 31]}。同样，体细胞获得的诱导性多能干细胞也可以根据胚胎干细胞的诱导方法进行分化。

作为再生医学研究的重要种子细胞，胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化潜能，可以进行体外基因操作和长期保存。但是试验表明胚胎干细胞进入机体后，很容易增生形成肿瘤，这也是目前需要解决的难题之一。目前，用于诱导胚胎干细胞分化的方法很多，但分化的效率不高亦是亟待解决的难题。尽管胚胎干细胞定向分化的技术仍然处于初级阶段，但是通过深入的研究和与相关学科的联合攻关，其在细胞移植、组织再生与修复等方面仍具有非常广阔的应用前景。