柴芩清热胶囊由柴胡、连翘、诃子、黄芩、大黄、甘草等组成，具有解肌透邪、清热泻火的功效，适用于感冒热证。证见恶寒、发热、头痛、身痛、咽痛或鼻塞、流涕等。经过多年临床应用证实，其具有较好的临床疗效。为有效控制其质量，确保该制剂的临床疗效，本试验对组方主要药味建立了定性鉴别方法，对方中君药黄芩的有效成分黄芩苷建立了高效液相色谱（HPLC）定量测定方法。试验结果显示，所建方法简便易行、灵敏准确、专属性强，可用于柴芩清热胶囊的质量控制。

Agilent高效液相色谱仪；Agilent N1100化学工作站；DAD二级阵列紫外检测器；依立特ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D型电子天平（德国赛多利斯）。

芩连清热胶囊（自制样品，共3批，批号20130301、20130302、20130303）；黄芩苷对照品（批号110715-200514，质量分数91.7%）、柴胡皂苷a对照品（批号110777-201309，质量分数92.0%）、柴胡皂苷d对照品（批号110778-200506，质量分数96.0%）、柴胡对照药材（批号120992-201108）、连翘苷对照品（批号110821-200340，质量分数95.3%）、连翘对照药材（批号120908-200512）、没食子酸对照品（批号110831-200302，质量分数89.9%）、诃子对照药材（批号121015-200503）、大黄对照药材（批号121249-201003）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯；去离子水。

取本品内容物3 g，加5%浓氨甲醇溶液20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚振摇洗涤2次，每次20 mL，合并乙醚液，弃去，水层用水饱和的正丁醇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次15 mL，弃去氨液，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15 mL，弃去水洗液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇2 mL使溶解，过中性氧化铝柱（100～200目，3 g，内径为1.2 cm），用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；再取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。按处方制备缺柴胡的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010版一部附录VI B）试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）配制、并在10℃放置后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加热至显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，结果见图 1。

图 1 柴胡鉴别薄层色谱图Fig.1 TLC of Bupleuri Radix

取本品内容物2 g，加水30 mL，加热回流20 min，趁热滤过，滤液用醋酸乙酯振摇提取3次，每次30 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加30%乙醇5 mL使溶解，加至已处理好的大孔树脂（D101，内径1.2 cm，高24 cm）上，用30%乙醇溶液30 mL洗脱，弃去洗脱液，再以50 mL 50%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1 g，同法制成连翘对照药材溶液；再取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；按处方制备缺连翘的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述溶液各5 μL，以三氯甲烷-甲醇（5:1）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见图 2。

图 2 连翘鉴别的薄层色谱图Fig.2 TLC of Forsythiae Fructus

取本品内容物0.5 g，加乙醇20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，用醋酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并醋酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加醋酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加醋酸乙酯制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。按处方制备缺诃子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸（6:4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见图 3。

图 3 诃子鉴别薄层色谱图Fig.3 TLC of Chebulae Fructus

取本品内容物3 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，再加盐酸2 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚振摇提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按处方制备缺大黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010版一部附录VI B）试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液10 μL、对照药材溶液4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，见图 4。

图 4 大黄鉴别薄层色谱图Fig.4 TLC of Rhei Radix et Rhizoma

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm），柱温25℃，流动相为甲醇-0.2%磷酸（49∶51），检测波长为280 nm，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。

取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，即得。

参照《中国药典》2010年版一部含黄芩的中药复方制剂项下含量测定方法试验。柴芩清热胶囊供试品提取方法选择超声处理，制得的供试品溶液25 mL，超声处理30 min，并对提取所用溶剂、超声时间进行考察。结果，确定提取溶剂为70%乙醇、超声时间为30 min。

按处方工艺制备缺黄芩药材的阴性样品，按2.2.3项下供试品方法制备，即得阴性供试品溶液。吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液，进样，测定。结果阴性样品不干扰黄芩苷的测定。见图 5。

图 5 黄芩苷对照品（A）、供试品（B）及阴性样品（C）色谱图Fig.5 Chromatogram of baicaalin (A), sample (B),and negative sample (C)

精密称取黄芩苷对照品，加甲醇制成47.6 μg/mL的溶液。分别精密吸取1、2、5、10、15 μL进样，依法测定，以黄芩苷质量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算得回归方程：Y=2 669.9X−2.980 6，r=1。表明黄芩苷在0.0436～0.654 μg与峰面积具有良好的线性关系。

精密量取黄芩苷对照品溶液（43.6 μg/mL），按上述色谱条件连续进样6次，每次进样10 μL测定，计算黄芩苷峰面积积分值的RSD值为1.09%，表明仪器的精密度良好。

取同一批（批号20130303）中试样品，按供试品溶液的制备方法制备；每隔一定时间测定一次，进样6次；计算黄芩苷峰面积积分值的RSD值为2.15%，表明供试品在10 h内稳定性良好。

取同一批（批号20130303）样品，研细，混匀；取约0.2g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，平行制备6份进行含量测定，每份测2次，取平均值。经计算供试品中黄芩苷平均含量为30.44 mg/g，RSD为1.38 %，重复性良好。

分别取已知含量的柴芩清热胶囊样品6份约0.1 g，精密称定，分别精密添加一定量的对照品，按供试品溶液制备方法制备，测定供试品中黄芩苷峰面积并计算加样回收率。结果表明，供试品中黄芩苷平均加样回收率为98.39%，RSD值为0.81%。

按供试品溶液的制备方法操作，对柴芩清热胶囊3批样品中黄芩苷进行含量测定，精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，计算样品中黄芩苷的质量分数，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 批样品中黄芩苷的含量测定结果 Table 1 Determination of baicalin in three batches of samples 批号 质量分数/（mg∙g−1） RSD/% 20130301 31.41 1.26 20130302 31.65 0.83 20130303 30.95 2.88

表 1 批样品中黄芩苷的含量测定结果 Table 1 Determination of baicalin in three batches of samples

复方中柴胡的薄层鉴别一直是个难点。柴胡主要含有皂苷和挥发油，此外还有黄酮类、多糖类、豆甾醇、木脂素、香豆素、色氨酸等^[1]。曾参照《中国药典》2010年版一部中柴胡药材的鉴别方法^[2]。结果在供试品色谱中，在对照药材相应的位置上斑点不清晰，而且底色较重。鉴别效果不理想。通过不断分析原因，多次试验，同时参考文献方法^{[3, 4, 5]}。主要是本处方中药味较多，杂质影响鉴别。柴胡皂苷易溶于水、稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解度最大，难溶或不溶于苯，氯仿等试剂。所以根据柴胡皂苷的性质进行了多步纯化。最后经过反复试验研究，采用三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）配制，并在10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，用2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液为显色剂，采用柴胡对照药材作对照，供试品样品中柴胡皂苷类成分斑点清晰，特征性强，阴性无干扰，该方法成熟，重复性好。