二母安嗽片由知母、玄参、罂粟壳、麦冬、款冬花、紫菀、苦杏仁、百合、浙贝母9味药组成，具有清肺化痰，止嗽定喘之功效，用于虚劳久嗽，春秋举发，咳嗽痰喘，骨蒸潮热，音哑声重，口燥舌干，痰涎壅盛等症^[1]。方中罂粟壳能敛肺、止痛，用于久咳之症。经药理学研究证明，吗啡作为罂粟壳的主要有效成分，可抑制咳嗽中枢，产生镇咳作用，同时激动中枢神经阿片受体而产生较强的镇痛和镇静作用^[2]。鉴于本方重用罂粟壳，对其中毒性成分吗啡进行定量分析可以确保临床使用的安全 有效。

SHIMADZU LC—2010AHT高效液相色谱仪，Solution色谱工作站，Mettler Toledo XS205型及Mettler AE 260型电子天平，Auto Science AS20500ADT型超声清洗仪。

吗啡（批号171201-201123）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。二母安嗽片（批号1009001、0704001、0704002，规格0.6 g/片）由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂提供。

色谱柱为phenomenex Luna C₁₈（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）（每100 mL加0.1 g庚烷磺酸钠）；柱温为40 ℃；体积流量为1.0 mL/min；检测波长220 nm^[3]；进样体积5 μL。理论板数按吗啡峰计算应不低于8 000。

取吗啡对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成20 μg/mL的溶液，即得。

取二母安嗽片，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入浓氨溶液0.5 mL，密塞，使润湿，再精密加入三氯甲烷25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

按处方配比及制法，制成缺罂粟壳的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

分别精密吸取吗啡对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图 1。吗啡出峰时间约为22.5 min，理论板数为16 000，阴性样品对主峰无干扰。

图 1 吗啡对照品（A）、二母安嗽片（B）和阴性对照样品（C）的HPLC色谱图Fig. 1 HPLC of morphine (A), Ermu Ansou Tablet (B), and negative sample (C)

取吗啡对照品储备液（97.68 μg/mL），逐级稀释至质量浓度分别为3.907、9.768、19.536、39.072、78.144 μg/mL的溶液，分别精密吸取上述稀释溶液和储备液各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，求得回归方程：Y＝1.575 2×10⁴X＋6.682 8×10³，r＝0.999 99。结果表明，吗啡在3.907～97.680 μg/mL与峰面积积分值呈良好的线性关系。

取同一样品（批号1009001）6份，制备供试品溶液，分别测定，计算，结果吗啡的平均质量分数为0.306 mg/g，RSD值为1.18%。

精密吸取同一供试品溶液（批号1009001）5 μL，连续进样6次，根据吗啡峰面积积分值计算，结果RSD值为0.51%。

精密吸取同一供试品溶液（批号1009001）5 μL，分别于0、3、9、18、24 h进样测定，结果吗啡峰面积积分值RSD为0.57%。

取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成40.16 μg/mL的溶液，精密吸取2 mL，置具塞圆底烧瓶中，减压回收溶剂至干，再取同一样品（批号1009001），研细，取约0.25 g，精密称定，置上述圆底烧瓶中，制备供试品溶液，共6份，进样测定，计算，吗啡平均回收率为96.78%，RSD值为0.64%。

取3批样品，每批2份，制备供试品溶液，进样测定，计算吗啡的质量分数。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 二母安嗽片中吗啡的测定结果 (n = 2) Table 1 Determination of morphine in Ermu Ansou Tablet (n = 2) 批号 吗啡/（mg·片−1） 0704001 0.174 0704002 0.181 1009001 0.187

表 1 二母安嗽片中吗啡的测定结果 (n = 2) Table 1 Determination of morphine in Ermu Ansou Tablet (n = 2)

3.1 流动相的选择

曾比较了不同比例的乙腈-磷酸盐缓冲液、甲醇-0.5%乙酸铵溶液-1%三乙胺溶液和甲醇-0.2%二乙胺溶液等常见的生物碱分离系统，结果均不能改善吗啡色谱峰的拖尾现象。吗啡属生物碱类成分，在流动相体系中加入负离子对试剂可以与其分子中的叔胺氮原子结构产生缔合作用，阻断与固定相未键合硅醇基的相互作用，从而改善色谱峰的展宽拖尾现象。另一方面，缔合后的离子对呈中性，降低了被分析物质的极性，从而延长了在色谱柱上的保留时间。经反复试验，确定以乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）（每100 mL加0.1 g庚烷磺酸钠）的分离效果最佳，吗啡色谱峰峰形对称，与杂质峰实现基线分离。

笔者曾采用甲醇直接提取的方式进行测定，但吗啡的提取率较低，提出的成分复杂，影响色谱分离。在此基础上增加酸化—碱化—三氯甲烷-异丙醇（9∶1）混合溶剂萃取的步骤^[4]，可以充分去除杂质干扰，但操作繁琐。鉴于吗啡在三氯甲烷中溶解性较好，最终确定了在碱性环境下用三氯甲烷直接提取的方法。经方法学验证试验表明，提取方式以超声处理的效率为高，并符合准确测定的要求。

取同一供试品溶液（批号1009001），分别使用Agela Venusil MP C₁₈、Shiseido Capcell PAK C₁₈和phenomenex Luna C₁₈（2）3种色谱柱对吗啡进行测定。结果表明，不同厂家色谱柱对测定结果无显著性影响（RSD值为1.38%）。

根据国家药典委员会中成药质量标准制定的相关指导原则，含毒性成分药物必须制定含量范围。本试验参考《中国药典》2010年版一部“罂粟壳”项下规定的吗啡含量范围0.06%～0.40%，成品转移率按60%计算（水提工艺），建议规定本品每片含罂粟壳以吗啡（C₁₇H₁₉O₃N）计，应为0.071～0.470 mg。