复方川芎滴丸以川芎、当归组方，方中川芎性温，味辛，富含苯肽类、酚酸类、生物碱类。功能活血行气、祛风止痛，主治血瘀气滞所致月经不调、痛经经闭、肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛、风寒湿痹、跌打肿痛等疾病^[1]，为君药。当归性温，味甘、辛，富含黄酮类、酚酸类、内酯类、苯酞类、多糖类^[2~3]，功能补血活血、调经止痛、润肠通便，主治血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、虚寒腹痛、风湿痹痛、跌扑损伤、痈疽疮疡、肠燥便秘^[4]，为臣药。二药作为复方川芎滴丸的药用成分，能够活血行气、祛风止痛、镇静解痉，用于预防和治疗冠脉循环功能不全，脑动脉硬化。为了更好地控制该制剂的质量，本实验利用高效液相色谱（HPLC）法建立了该制剂的质量标准，对制剂中当归、川芎进行薄层色谱定性鉴别，并对制剂中主要成分阿魏酸进行了定量研究。

LC3000型高效液相色谱仪（创新通恒，二元梯度泵，UV检测器，CXTH—3000工作站），色谱柱为YMC-Pack ODS-A（AA20S11-2546WT，250 mm×4.6 mm，10 μm），RPL—D2000柱温箱（大连日普利科技仪器有限公司），UV—1700岛津紫外可见分光光度计，BT125D电子天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），HH—S2恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）。阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号110773-201012）；川芎对照药材（中国食品药品检定研究院，批号120918- 200406）、当归对照药材（中国食品药品检定研究院，批号120927-201014）；复方川芎滴丸（舒脑心滴丸）（中国人民解放军第88医院，山东泰安，批号130426、130522、130531）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；醋酸（天津市百世化工有限公司，分析纯）；磷酸（沈阳沈一精细化学品有限公司，分析纯）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；水为超纯水。

取本品5粒，研细，加石油醚5 mL超声溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取当归、川芎对照药材各2 g，置具塞烧瓶中，加乙醚25 mL，超声提取20 min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，分别吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；再喷以改良碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同的橙黄色斑点，见图 1。

图 1 复方川芎滴丸中当归、川芎的薄层色谱鉴别Fig. 1 TLC of Angelica sinensis and Chuanxiong Rhizoma

1）测定波长的考察 精密称取阿魏酸对照品适量，甲醇溶解，制成1 μg/mL溶液，以甲醇为空白，在紫外可见分光光度计在200～700 nm波长下进行扫描。结果，阿魏酸在321 nm处有较强吸收，参照《中国药典》2010年版一部药材和饮片川芎中阿魏酸的HPLC检测波长为321 nm^[5]，故选择321 nm为检测波长进行测定。

2）流动相的选择 本实验阿魏酸样品采用4个不同系统的流动相：乙腈-0.1%磷酸（22∶78）^[6]、乙腈-1%冰醋酸（30∶70）^[5]、甲醇-0.1%磷酸（40∶60）^[7]、甲醇-1%冰醋酸（30∶70）进行测定，同时考察各系统不同组成比例的流动相，结果流动相为甲醇-1%醋酸（30∶70）时阿魏酸出峰时间适中，约16 min，分离度好。柱温30 ℃，体积流量1.0 mL/min，理论塔板数按阿魏酸峰计不低于3 000。

3）提取方法的选择 取同一批样品（130522）共4份，各0.170 1 g，分别精密称定，放入50 mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称质量，其中两份加热回流30 min，另两份超声处理30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。在流动相甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件下测定样品中阿魏酸峰面积，得到超声提取样品中阿魏酸平均质量分数为7.146 5 mg/g，加热回流提取为7.755 5 mg/g。结果显示，回流提取测得样品的阿魏酸质量分数高于超声处理的样品，故将加热回流提取方法定为提取方式。

4）提取时间的选择 取同一批样品（130522），共6份，各0.172 1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，分别加热回流15（2份）、30（2份）、45 min（2份），放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。在流动相甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件下测定样品中阿魏酸，得到加热回流提取15 min样品中阿魏酸平均质量分数为7.208 9 mg/g，30 min为7.755 5 mg/g，45 min为6.877 1 mg/g。结果显示，提取时间为30 min，均比其他两个时间段阿魏酸质量分数高，故将提取时间定为30 min。

5）提取溶剂的选择 取同一批样品（130522）共6份，各0.170 3 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入50%（2份）、70%（2份）、100%（2份）甲醇各50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，分别用50%、70%、100%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。在流动相甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件下测定阿魏酸，得到50%甲醇提取样品中阿魏酸平均质量分数为7.070 5 mg/g，70%甲醇为7.755 5 mg/g，100%甲醇为6.999 4 mg/g。结果显示，提取溶剂为70%甲醇时，测得的样品中阿魏酸质量分数较高，故选择70%甲醇为提取溶剂。

6）提取溶剂量的选择 取同一批样品（130522）共6份，各0.170 9 g，精密称定，至于圆底烧瓶中，分别加入70%甲醇30（2份）、50（2份）、70 mL（2份），称定质量，加热回流30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。在流动相为甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件下测定样品中阿魏酸峰面积，得到30 mL甲醇提取样品中阿魏酸平均质量分数为5.626 2 mg/g，50 mL为6.164 3 mg/g，70 mL为5.866 8 mg/g。结果显示，提取溶剂用量为30、50、70 mL时阿魏酸质量分数相差不大，50 mL时样品浓度较为适中，故将提取溶剂用量定为50 mL。

7）提取次数的选择 取同一批样品（130522），共6份，各0.170 7 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，分别加热回流提取1（2份）、2（2份）、3次（2份），放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。在流动相甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件下测定样品中阿魏酸峰面积，得到提取1次样品平均质量分数为5.633 9 mg/g，2次为5.521 4 mg/g，3次为5.522 2 mg/g。结果显示，提取次数为1次时，与2次、3次相差不大，故将提取次数定为1次。

精密取阿魏酸对照品2.000 0 mg，加入70%甲醇定容至100 mL，制成0.020 0 mg/mL的对照品溶液，即得。

取3批样品各0.170 4 g，精密称定，至于圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得。

取缺少当归和川芎的处方药，按制备工艺制得样品，再按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制得阴性样品溶液。

1）专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液进样20 μL，结果显示供试品中各待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质峰及空白溶液对待测成分均无干扰，见图 2。

图 2 阴性对照品（A）、供试品溶液（B）、对照品品溶液（C）HPLC图谱Fig. 2 HPLC of negative sample (A), Compound Chuanxiong Rhizoma Pills sample (B), and reference substances (C)

2）不同色谱柱的考察 选用3种不同的色谱柱，即YMC-Pack ODS-A（AA20S11-2546WT，250 mm×4.6 mm，10 μm）、TC-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）、HC-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），按甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件分析，记录样品中阿魏酸色谱图，结果显示，各色谱柱均分离效果良好，且理论塔板数均大于3 000。

3）线性关系的考察 精密取阿魏酸对照品2.000 0 mg于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解定容至刻度，制成0.200 0 mg/mL对照品溶液，再精密量取适量对照品溶液配成0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mg/mL的阿魏酸对照品溶液，分别进样20 μL，按甲醇-1%醋酸色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为Y＝8.7×107X＋39 031，r＝0.999 5。结果表明阿魏酸在0.001～0.1 mg/mL与峰面积呈线性关系。

4）精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（130522）20 μL，按甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件，连续进样6次，记录色谱条件测定的峰面积，计算峰面积值的RSD值为1.50%。

5）重复性试验 精密称取同一批样品（130522）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定各样品中阿魏酸的质量分数。计算样品中阿魏酸平均质量分数的RSD值为1.85%。

6）稳定性试验 取同一批样品（130522）2份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8、10、12 h，测定样品中阿魏酸峰面积，计算样品中阿魏酸峰面积值的RSD值为1.95%（n＝7），表明阿魏酸在12 h内稳定。

7）加样回收率试验 精密称取同一批样品（130522）0.085 0 g（共6份），分别加入0.200 0 mg/mL阿魏酸对照品溶液各2.43 mL，称定质量，再按照“2.3”供试品溶液制备方法，制成回收率供试品溶液，按甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件分析，计算回收率，结果平均回收率为102.06%，RSD值为2.25%（n＝6）。

取3批样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按甲醇-1%醋酸（30∶70）色谱条件，采用外标法计算，测定3批样品中阿魏酸的量。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 复方川芎滴丸中阿魏酸的测定结果 (n= 2) Table 1 Determination of ferulic acid in Compound Chuanxiong Rhizoma Pills (n = 2) 批号 阿魏酸 / (mg∙g−1) 130426 7.885 1 130522 5.677 8 130531 5.374 5

表 1 复方川芎滴丸中阿魏酸的测定结果 (n= 2) Table 1 Determination of ferulic acid in Compound Chuanxiong Rhizoma Pills (n = 2)

在原部队制剂标准中，当归、川芎的薄层验证中样品取样量为2粒，对照药材取样量为1 g时，浓度太小影响荧光斑点的呈点性，故将取样量改为5粒，对照药材取样量为2 g，斑点呈点清晰。修订后的当归、川芎薄层鉴别方法专属性及重复性良好，故将标准草案中的当归、川芎薄层鉴别方法进行了修订。同时以阿魏酸为对照品，改进了阿魏酸的含量测定方法，首次运用了HPLC法对复方川芎滴丸的阿魏酸进行了定量。

在波长选择中，进行了紫外扫描，确定了阿魏酸在321 nm处有最大吸收，同时参考相关文献，确定本实验中阿魏酸的检测波长为321 nm。根据指标性成分的理化性质和色谱行为，比较了不同流动相、提取方式、提取时间、提取溶剂、提取溶剂用量和提取次数对样品中阿魏酸的影响，以当归和川芎中的阿魏酸为指标，优选了最佳提取制备工艺。结果显示，制备工艺方法简单可靠，具有科学性和可行性。

有关HPLC法测定阿魏酸的方法已有报道^{[8, 9, 10]}，但尚未有复方川芎滴丸中阿魏酸定量研究的文献报道。本实验在原有利用薄层色谱法测定阿魏酸的基础上，首次采用HPLC法测定了复方川芎滴丸不同批次样品中阿魏酸的量，结果显示阿魏酸的测定更准确，建立了一种快速测定复方川芎滴丸中阿魏酸的方法，通过线性关系考察，证明线性关系良好、重复性、重现性、稳定性、回收率均符合要求，为制订其质量标准提供了参考，修订后的质量标准，提高了药品的质量控制水平。