彗星试验（comet assay）又称单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis）。1984年，Ostling和Johanson首次采用该技术在中性条件下检测单细胞的DNA双链断裂^[1]。1988年，Singh等^[2]建立了碱性（pH＞13）单细胞凝胶电泳方法，该技术不仅可检测DNA的单、双链断裂，还可检测不完全修复位点，不稳定的碱基位点，DNA-蛋白质交联和DNA-DNA交联等。根据细胞来源不同，彗星试验可分为体内试验和体外试验。顾名思义，体内彗星试验就是采用单细胞凝胶电泳方法检测生物体内细胞有无DNA 损伤的试验，具有以下优点^[3]：可检测体内任何组织和（或）特定细胞类型；可以检测多种与DNA单、双链相关的遗传毒性损伤；试验灵敏度高；每个样本仅需少量细胞；操作流程简便；试验周期短；所需费用较少。

20世纪90年代，人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）和经济合作发展组织（OECD）颁布了一系列遗传毒性相关指导原则，用于药物评价的遗传毒性标准组合及试验技术方法均未出现大的变化。而2011年11月，ICH正式颁布了新的遗传毒性指导原则S2（R1），增加了一种全新的试验标准组合，包含细菌回复突变试验和两种不同组织/终点的体内试验，并推荐将体内彗星试验作为第二项体内试验^[4]。这是国际权威机构首次将彗星试验纳入遗传毒性指导原则。体内彗星可作为体内微核试验重要的补充^[5]，在遗传毒理学研究上有非常重要意义。但其在药物遗传毒性评价中的应用却极少，仅见于遗传毒性常规评价方法外的补充研究，尚无相关的指导原则，国内大部分实验室还没有方法学建立。本文重点关注在药物评价中体内彗星试验应如何开展，以期对相关方法学建立提供一些参考。

体内彗星试验一般选用啮齿类动物（大鼠、小鼠）。根据S2（R1）建议，在可能的情况下应将体内试验与重复给药试验相整合。若同一受试物需进行两个遗传毒性体内试验，应尽可能整合在一个试验中（如体内微核和彗星试验），则更符合替代、减少、优化（replacement、reduction、refinement，3R）原则，并可以节约时间成本。在性别选择方面，可选用两种性别动物；当受试物毒性或代谢在性别间无明显差异时，也可选用单一性别动物（如微核试验常选用雄性动物）；如果受试物专用于某一性别人群，则通常选用相应性别的动物进行试验。

试验一般应包括阴性对照组（溶媒对照组），受试物低、中、高剂量组和阳性对照组。Wiklund和Agurell推荐每组一般应包括4～5只动物^[6]。

基本与OECD 474哺乳动物红细胞微核试验指导原则相一致，对无明显毒性受试物的单次给药或重复给药时间≤14 d的上限剂量为2 000 mg/kg，而重复给药时间＞14 d的上限剂量为1 000 mg/kg^[7]；对有明显毒性受试物，高剂量应产生明显毒性，除非动物出现不能接受的毒性信号和（或）靶组织发生极端的细胞毒性。相邻的剂量间隔一般为2～3倍^[4]。

以前的体内彗星试验一般多采用单次给药。但近年来也常见多次给药的报道^[5,8]，时间跨度可从几天至几周不等。由于试验整合和采样时间的需要，多次给药逐渐会得到更广泛的应用。

原则上彗星试验可适用于任何组织，但在缺少相关受试物的靶组织信息时，肝脏被认为是最适宜的靶组织。值得注意的是，有一小部分致癌物可在肝脏遗传毒性检测呈阳性结果，而在骨髓检测呈阴性结果，可能与代谢产物不能有效进入骨髓有关^[4]；其次是胃、肠等可与受试物直接接触的组织（当肝脏的遗传毒性检测为阴性时）。靶组织的选择主要依据163个啮齿类动物和30个非啮齿类动物致癌物的相关彗星测定结果所进行的综合评估^[9]。

对于单次给药的试验，一般为2个采样时间，给药后几小时内和24小时左右；而对于重复给药的试验，可采用最后1次给药后2～6 h单次采样^[4]。结合微核试验，已有的研究表明微核试验中连续给药3 d及以上，骨髓微核的水平在最后1次给药后0～24 h内保持稳定。这样在多次给药时，可解决采样时间上的矛盾。

从组织中获取单细胞悬液可采用胶原酶或胰蛋白酶等消化方法，也可采用组织擦刮法、剪碎法、灌洗法或液氮冷冻^[10]等机械方法，以及匀浆以释放细胞核。在采用机械法时，应加入乙二胺四乙酸（EDTA）^[10]螯合钙、镁离子以便阻止核酸内切酶激活，而加入自由基清除剂，如二甲基亚砜（DMSO），能阻止氧化诱导的DNA损伤^[11]。

为保证研究结果的重现性和可靠性，涉及碱性（pH＞13）单细胞凝胶电泳的所有试验步骤均同等重要。一般而言，在样品制备、溶液制备和应用、仪器使用和维护方面采用严格的质量控制标准，将会获得理想的试验结果。

长久以来，采用载玻片上制备凝胶的方法得到广泛应用^[12]。为了增加凝胶与玻片结合的稳固性及减少背景干扰，琼脂糖层数常被铺设为1～3层。在单层琼脂糖制备上，细胞被混悬于低熔点琼脂糖（一般37 ℃）中并直接置于玻片上；制备3层琼脂糖时，玻片预先铺设1层正常熔点琼脂糖，后加入细胞层琼脂糖，最后再铺设1层低熔点琼脂糖；而在制备两层琼脂糖时，省略了3层制备上最后铺设的低熔点琼脂糖。在琼脂糖凝固前取适当尺寸的盖玻片加以覆盖，以便在凝固时获得平整的、便于观察的表面，一般正常熔点琼脂糖浓度为1.0%～1.5%，低熔点琼脂糖浓度为0.5～1.0%，高浓度的琼脂糖可影响DNA迁移的长度。细胞浓度和琼脂糖浓度一样，是确保试验成功的重要参数，较高的细胞密度导致过多的彗星重叠，特别是存在高水平DNA迁移时。因此，适当的细胞数量应保证在每个视野中至多有几个细胞。

近年来，随着科学技术的发展，有研究者^[13]使用一种可黏附低熔点琼脂糖的Gelbond^®膜替代底层琼脂糖，为低熔点琼脂糖提供了一个可黏附的表面，避免了玻片制胶易脱落的缺点，无需使用盖玻片，极大的简化了试验操作，提高了试验的稳定性。目前，该方法已通过微孔列阵技术实现了高通量检测^[14]，可检测多个样品，最高达96个，具有广阔的应用前景，也更易标准化，但价格昂贵。

待琼脂糖凝固后，取下盖玻片，浸入预冷的（4 ℃）裂解液（含高盐及去污剂）中，使细胞充分裂解。裂解液早期由Singh等^[2]提出，包含100 mmol/L的EDTA、2.5 mol/L的NaCl、1%肌氨酸钠、10 mmol/L Tris，调pH值至10，临用前加入1%的Triton X-100。接下来，Tice等^[15]加入10%的DMSO，以保护样品（血液及组织）在裂解过程中释放的铁离子所诱导的DNA损伤。再之后，McKelvey-Martin等^[16]报道，肌氨酸钠并非裂解液中所必需的。但是，一些特殊的细胞类型可能需要第二种去污剂才能完全裂解。裂解液临用前需预冷，以保持琼脂糖凝胶的稳定性。裂解时间主要依赖于细胞类型，可由1 h至数周不等。

电泳前，玻片先在碱性（pH＞13）电泳缓冲液中产生单链DNA以检测单链DNA损伤。碱性溶 液^[2]包含1 mmol/L的EDTA和300 mmol/L的NaOH，pH＞13。解旋时间一般为20 min，如应用较短的解旋时间，则需对双链DNA是否变成单链DNA做出说明。

碱性解旋后，琼脂糖凝胶中单链DNA在碱性条件下继续电泳以产生彗星。电泳条件^[2]一般为25 V电压、300 mA电流，电泳时间为20 min。随着电泳仪规格的多样化，电压采用V/cm表示更准确，电压的一般范围是0.7～1.0 V/cm。

电泳后，碱性凝胶玻片需要在合适的缓冲液（如pH＝7.5的Tris缓冲液）中漂洗中和，Singh等^[2]提出的规程是3次漂洗，每次5 min。如果在评分过程中出现较高背景值时，增加冲洗次数会起到积极作用^[17]。中和后，早期的试验一般是在合理的时间内评分（如24 h），以避免DNA的过度扩散。近期的试验一般是将琼脂糖凝胶先浸于无水乙醇或甲醇中短暂脱水^[18]（如5 min），或室温下干燥。干燥后经中性福尔马林固定，可保存较长时间。

DNA染色常使用荧光染料，而应用最为广泛的是溴化乙啶（EB）^[19]，其他还可以使用碘化丙啶 （PI）^[20]、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）^[21]、SYBR Green I^[22]和苯并恶唑啉（YOYO-1）^[23]等。而非荧光染色主要采用硝酸银染色技术^[24]，较荧光染色具有易于保存、可随时观察、对研究人员伤害小等优点，但显色效果一般。彗星成像倍数一般200×至400×最为常见，主要依赖于评价细胞的类型、彗星迁移的范围以及显微镜和（或）成像系统的相关参数。

所有玻片在显微镜观察前均应进行编号标记，每只动物一般采集50～100个细胞，选用适宜的分析方法。广泛应用的方法是根据DNA迁移的长度和（或）尾部DNA所占比例进行分级评分，如分为4级^[25]（0～3）或5级^[22]（0～4），0为无可见尾部，4为绝大部分DNA 在尾部。此法虽具有一定的主观性，精确性较差，但有较好的实用价值。同时，也可根据不同的分析系统对各种相关指标进行精确统计，常用指标有：彗星全长（comet length）、尾长（tail length）、尾部DNA百分含量（tail DNA%）、尾矩（tail moment，尾长与尾部DNA百分含量的乘积）、OLIVE尾矩^[26]（彗星头尾中心间距与尾部DNA百分含量的乘积）等，均能很好的反映DNA损伤的程度。

近年来，体内彗星试验在遗传毒性研究中的优势和价值逐渐显现，开始获得了ICH、OECD等国际权威机构的认可和推广，具有了更广阔的发展空间。体内彗星试验在GLP条件下的建立和应用将有助于药物遗传毒性的准确评价，特别是当常规遗传毒性评价结果为可疑阳性时，可作为非常重要的备选试验。但由于缺乏权威机构的实验指南作为指导，各实验室在进行体内彗星试验时，在应用条件和分析方法上不尽相同，在个别步骤上仍存有分歧，导致了研究结果的可比性、重复性较差。而要将其引入相对成熟和稳定的药物遗传毒性评价上来，势必还要在单细胞获取、玻片制备、DNA染色及彗星评分等细节的规范上多下功夫。这就需要各实验室相关研究人员紧跟国际研究进展，在试验中不断开拓创新、善于分析总结并及时沟通交流，首先应在丰富理论和实践经验的基础上，建立适用于本实验室的实验方法学，之后应尽可能的简化和标准化操作规程，以便减少干扰并获得真实、完整、可靠的评价结果。同时，也需药政相关部门及时掌握国际相关指导原则最新动态，结合我国国情，对遗传毒性指导原则进行及时及必要的修订，帮助相关人员掌握新方法、新技术，提高我国药物遗传毒性研究水平并与国际接轨。