丹参最早收载于《神农本草经》，被列为上品，其功效主要是祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等^[4]。本课题组提取了丹参中的酚酸类成分，制备了冠心舒胶囊，动物体内的药理实验表明，冠心舒胶囊能很好的治疗心血管系统疾病^{[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]}。在本研究中，建立大鼠血浆中丹参素的LC-MS/MS测定方法，并将该方法应用于冠心舒胶囊在大鼠体内的药动学研究。

沃特斯Premier XE三重四级杆串联质谱仪和Acquity超高效液相（美国沃特斯公司），沃特斯BEH C₁₈ column（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特斯公司）。

丹参素（danshensu，DSS）对照品（批号134678-201101）和对羟基苯甲酸对照品（批号389213-201005）购自中国食品药品检定研究院，质量分数均为99.3%。冠心舒胶囊（批号20100912）由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心制备。甲醇、乙腈（色谱级，美国Fisher公司），醋酸乙酯（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司），甲酸（色谱级，Sigma公司）。

SD大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（合格证号SLK20110215）。

取丹参素约12.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成质量浓度是500 μg/mL的储备液Ⅰ。稀释储备液Ⅰ，制备质量浓度是10 μg/mL的储备液Ⅱ。

将储备液Ⅱ逐级稀释，制备质量浓度分别是1、2、5、50、100、500、1 000 ng/mL的系列标准曲线溶液。将储备液II稀释，制备低、中、高3个质量浓度的质量控制（QC）溶液，质量浓度分别是2、500、800 ng/mL。所有溶液置于4 ℃冰箱保存。

取对羟基苯甲酸10.1 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成质量浓度是505.0 μg/mL的储备液。取该储备液适量，用水稀释成质量浓度是1.0 μg/mL的内标工作溶液。

2.1.3 血浆样品的处理方法

取血浆样品60 μL，加入内标工作溶液60 μL，水60 μL，加10 μL的盐酸溶液（1 mol/L），涡旋1 min之后，加入1.5 mL的醋酸乙酯溶液，涡旋5 min后，5 000 r/min离心，取上清液，37 ℃氮气吹干，残留物用200 μL乙腈-水（80∶20）的混合溶液复溶，取5 μL进行LC-MS/MS分析。

色谱柱为沃特斯UPLC BEH C₁₈ column（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特斯公司）。流动相A是乙腈，流动相B是水（含0.1%甲酸），梯度程序如下：0 min，5%A；2.6 min，30%A；2.61 min，5%A；4.0 min，5%A。体积流量0.2 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。弱洗和强洗溶液分别是乙腈-水-0.1% 甲酸（5∶95∶0.1）和乙腈-水-0.1% 甲酸（95∶5∶0.1）。

离子源：ESI源，负离子检测，高纯氮气用作脱溶剂气（600 L/h）和锥孔气（50 L/h），气体温度380 ℃，离子源温度是120 ℃，毛细管电压2 700 V，锥孔电压是22 V。以多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）为扫描模式，用于定量反应的离子分别是197→135（丹参素，碰撞能量是17 eV），137→93（对羟基苯甲酸，碰撞能量是22 eV）。二级扫描图见图 1。

图 1 丹参素（A）和对羟基苯甲酸（B）的MRM图Fig. 1 Representative MRM chromatograms of DSS (A) and p-hydroxybenzoic acid (B)

分别取6只大鼠的空白血浆60 μL，除不加内标外（补加相应体积的甲醇），其余按照2.1.3操作，进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆色谱图，见图 2A；将最低定量限的丹参素和内标加入到空白血浆中，按照2.1.3操作，获得色谱图，见图 2B；取大鼠给药后的血浆60 μL，按照2.1.3操作，获得样品色谱图，见图 2C。由图 2可知，空白血浆中内源性物质不干扰丹参素和内标的测定。

1-丹参素；2-对羟基苯甲酸 1-DSS; p-hydroxybenzoic acid 图 2 空白血浆（A）、空白血浆加最低定量限的丹参素和内标（B）及大鼠给予冠心舒胶囊后的血浆（C）LC-MS/MS谱图 Fig. 2 LC-MS/MS chromatogram of blank rat plasma sample(A), blank plasma spiked with DSS at LLOQ and IS(B), and rat plasma sample following an oral dose of Guanxinshu Capsule (C)

取空白血浆60 μL，分别加入系列标准溶液60 μL，按照2.1.3操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图，连续记录3 d。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得回归方程如下，丹参素：Y＝0.007 2X－0.008 5，r=0.9956，线性范围1.0～1 000.0 ng/mL。信噪比（S/N）为10时丹参素的最低定量限是1.0 ng/mL。

取空白血浆60 μL，将60 μL的水换成相应体积的QC样品，其余按照2.1.3操作，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行，计算QC样品的测得浓度，与配制浓度对照，计算精密度与准确度，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 LC-MS/MS法测定丹参素的精密度和准确度 Table 1 Precision and accuracy of DSS in rat plasma by LC-MS/MS 质量浓度 (μg∙L−1) RSD/% RE/% 加入量 实测值 日间 日内 2.0 1.9 6.8 7.4 −5.0 500.0 534.1 8.2 5.3 6.8 800.0 865.3 3.9 6.7 8.1

表 1 LC-MS/MS法测定丹参素的精密度和准确度 Table 1 Precision and accuracy of DSS in rat plasma by LC-MS/MS

取空白血浆60 μL，将60 μL的水换成相应体积的QC样品，其余按照2.1.3操作，制备低浓度和高浓度的质量控制血浆样品，6样本平行分析，峰面积是A₁；另取空白血浆60 μL，按照2.1.3操作，残留物用丹参素QC样品的溶液溶解，制成的样品浓度分别是丹参素（2.0、800.0 ng/mL）进样分析，获得峰面积是A₂。以每一浓度正常提取样品所得的峰面积A₁，与未提取样品峰面积A₂均值的比值计算提取回收率。内标按照同样的方法测定回收率。丹参素和内标的提取回收率分别是 （87.1±6.6）%和（89.3±5.4）%。

丹参素低浓度和高浓度的QC样品分别进样分析，记录峰面积A₃。与2.3.4制备的血浆样品的峰面积A₂进行比较，以同一质量浓度血浆基质样品的峰面积A₂和无基质样品的峰面积A₃的比值计算基质效应。丹参素的平均基质效应是（106.5±3.7）%。

考察处理后的血浆样品4 ℃放置24 h的稳定性，考察血浆样品在3个冻融循环（−80～22 ℃），长期稳定性（−80 ℃放置30 d）和室温放置2 h的稳定性。实验结果表明，样品在上述条件下是稳定的。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 丹参素在不同条件下的稳定性 Table 2 Stability of DSS in human plasma under different conditions 储存条件 质量浓度/ (ng∙mL−1) 加入量 实测值 RSD/% RE/% 室温放置2 h 2 1.9 4.3 −5.0 800 771.2 5.2 −3.6 3个冻融循环 （−80～22 ℃） 2 2.1 3.8 5.1 800 857.6 5.7 7.2 4 ℃放置24 h 2 1.8 6.2 −10.1 800 838.4 4.9 4.8 −80 ℃放置30 d 2 2.2 8.1 9.6 800 848.0 3.2 6.0

表 2 丹参素在不同条件下的稳定性 Table 2 Stability of DSS in human plasma under different conditions

6只SD大鼠，给药前禁食过夜，给水，ig给予冠心舒胶囊内容物的羧甲基纤维素钠混悬液，在5.0、15.0、30.0 min和1、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h眼眶取血0.2 mL，放置在涂有肝素的离心管中，4 000 r/min离心10 min，取血浆，放在−80 ℃冰箱中待测。

按照2.1.3进行血浆样品的处理，同时制备丹参素低、中、高3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行双样本分析。以当日的标准曲线计算QC样品及各时间点样品中丹参素的质量浓度，质量控制样品测定结果的RE在±15%之内。血药质量浓度-时间曲线见图 3。

图 3 大鼠口服冠心舒胶囊后的血药浓度-时间曲线Fig. 3 Blood drug concentration-time profiles of DSS following oral administration of Guanxinshu Capsule

丹参素大鼠体内的最大血药浓度（C_max）和达峰时间（T_max）直接由实测值读出。由血药浓度-时间曲线末四点做半对数图，以lgC-t按最小二乘法进行线性回归，所得斜率的绝对值即为消除速率常速（k_e）；消除半衰期（t_1/2）为ln2/k_e。药时曲线下面积（AUC_0-t）由梯形法求得。C_max和T_max分别是245.7 ng/mL和1.5 h，AUC_0-t是1582.1 ng·h/mL，消除半衰期（t_1/2）是2.1 h。

本文建立了HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中的丹参素浓度。本方法灵敏度高，满足了血浆样品中低浓度成分的测定。液液萃取的样品制备方法提高了样品的洁净度，降低了基质效应。最后本方法成功应用于冠心舒胶囊大鼠体内的药动学研究，为中药新药的开发提供了支持。