芪贞慢咽宁颗粒是江苏省名中医研制的中药复方制剂，处方由黄芪、制女贞子、白术（炒）、木蝴蝶等7味药材组成，具有滋阴、养阴益气、生津润燥的功效，用于气阴两虚、津亏失润而致的慢性咽炎，临床常见咽喉肿痛、痰咳不利。木蝴蝶具有清肺利咽、疏肝和胃的功效^[1]，为方中主要组分。木蝴蝶中以黄酮及其苷类成分为主，许多成分在黄芩中都已经发现过，但木蝴蝶苷B在黄芩和其他植物中没有发现过^[2]，为木蝴蝶专属性成分^[3]。近年来，有文献报道木蝴蝶苷B在体内外都具有很好的抗淋巴瘤效应，低剂量的木蝴蝶苷B能够有效地抑制淋巴瘤细胞生长，显著降低淋巴瘤细胞的致瘤性，但对细胞周期和凋亡均无明显影响，作用机制不同于常用抗癌化疗药物的机制^[4-5]。张昌壮等采用HPLC法测定木蝴蝶中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B^[6]，李慧等^[7]采用HPLC法测定木蝴蝶配方颗粒中木蝴蝶苷B和黄芩苷。《中国药典》2015年版一部首次以木蝴蝶苷B作为木蝴蝶药材的测定指标，并规定其限度^[1]。因此本研究建立HPLC法测定芪贞慢咽宁颗粒中木蝴蝶专属性成分木蝴蝶苷B，并将其作为评价芪贞慢咽宁颗粒质量控制指标之一，为制剂质量评价提供依据。

Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），Mettler Toledo XS205DU Dual Range型分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），KH-700DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），GWA-UN2-C30型超纯水器（北京普析通用仪器有限公司）。

木蝴蝶苷B对照品（批号111915-201202）由中国食品药品检定研究院提供；芪贞慢咽宁颗粒由扬子江药业集团有限公司生产，规格10 g/袋，产品批号分别为15090641、15091441、15091641；甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯试剂。

Kromasil 100-5 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇-0.1%磷酸（38:62），检测波长276 nm，体积流量1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL。理论塔板数按木蝴蝶苷B峰计算应不低于2 000。

取木蝴蝶苷B对照品12 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；精密吸取上述溶液5 mL，置20 mL量瓶中，加50%甲醇稀释，并定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

取芪贞慢咽宁颗粒适量，研细，取约1.5 g，精密称定，加50%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按处方比例称取缺木蝴蝶处方药材，按工艺方法制备缺木蝴蝶阴性样品，按供试品溶液的制备项下方法操作制备阴性样品溶液。

分别精密吸取木蝴蝶苷B对照品储备液0.5、1、2、3、5、7、10 mL，分别置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释，并加至刻度，摇匀，即得系列质量浓度的对照品溶液。按以上色谱条件进样测定峰面积值。以木蝴蝶苷B峰面积值为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归处理，得回归方程Y＝11.802X－2.113（r＝0.999 0）。结果表明木蝴蝶苷B在0.064 6～1.292 0 μg与峰面积的线性关系良好。

分别量取适量阴性样品溶液、对照品溶液和供试品溶液，按以上色谱条件测定，结果阴性样品溶液在与木蝴蝶苷B对照品色谱峰相同保留时间处无色谱峰，故认为无干扰，见图 1。

图 1 缺木蝴蝶的阴性样品（A）、木蝴蝶苷B对照品（B）和芪贞慢咽宁颗粒（C）的HPLC图谱 Fig. 1 HPLC chromatograms of negative sample without Oroxyli Semen, oroxin B reference substance (B), and Qizhen Manyanning Granules (C) *-木蝴蝶苷B *-oroxin B

取批号15091441芪贞慢咽宁颗粒样品，制备供试品溶液，连续进样6次，记录木蝴蝶苷B色谱峰峰面积，结果木蝴蝶苷B峰面积的RSD值为0.27%。

取批号15091441芪贞慢咽宁颗粒样品，制备供试品溶液，置室温下，分别于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h进样测定峰面积。结果木蝴蝶苷B峰面积的RSD值为0.43%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

取批号15091441芪贞慢咽宁颗粒6份，制备供试品溶液，进样测定，记录木蝴蝶苷B峰面积。结果样品中木蝴蝶苷B的平均质量分数为1.14 mg/g，RSD值为0.51%。

采用加样回收率法。取批号15091441芪贞慢咽宁颗粒样品0.75 g，精密称取6份，分别精密加入0.2395 mg/mL木蝴蝶苷B对照品储备液4 mL，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果平均回收率为100.67%，RSD值为1.12%。

对不同批次的芪贞慢咽宁颗粒进行处理，制备供试品溶液，进样测定，按外标法以峰面积计算木蝴蝶苷B的平均质量分数，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 芪贞慢咽宁颗粒中木蝴蝶苷B的测定结果（n=3） Table 1 Determination of oroxin B in Qizhen Manyanning Granules (n=3) 批号 木蝴蝶苷B/（mg·g-1） 15090641 1.34 15091441 1.11 15091641 1.22

表 1 芪贞慢咽宁颗粒中木蝴蝶苷B的测定结果（n=3） Table 1 Determination of oroxin B in Qizhen Manyanning Granules (n=3)

考察50%、80%、100%甲醇为溶剂提取制备供试品溶液，结果显示不同体积分数甲醇制备得到的供试品溶液中木蝴蝶苷B峰型、分离度无明显差异，低体积分数甲醇的目标峰理论塔板数稍高，故选定50%甲醇为提取溶剂。

比较加热回流30 min和超声30 min以及分别超声20、30、40 min，均测2份样品取平均值。结果回流30 min和超声30 min测定的蝴蝶苷B质量分数分别为0.99、1.01 mg/g。超声20、30、40 min测定的蝴蝶苷B质量分数分别为1.01、1.01、1.02 mg/g。结果表明，超声和回流处理对木蝴蝶苷B测定结果无明显差异，且超声不同时间对其测定结果影响不大。因此供试品溶液的制备直接超声20 min即可。

《中国药典》2015年版一部木蝴蝶药材中木蝴蝶苷B的HPLC测定所用流动相为甲醇-水-磷酸（42:58:0.2）^[1]。但芪贞慢咽宁颗粒为复方制剂，成分较多，采用甲醇-水-磷酸（42:58:0.2）不能达到基线分离。经反复试验，当甲醇、0.1%磷酸水溶液比例为38:62时，木蝴蝶苷B峰型较好，保留时间适中，分离度大于1.5，且低体积分数的酸溶液对色谱柱有较好的保护作用。实验中考察3根不同品牌色谱柱对样品测定结果和分离效果的影响，分别为Kromasil 100-5 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shim-pack VP-ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。不同品牌色谱柱测得的木蝴蝶苷B平均质量分数均为1.19 mg/g，RSD值为2.53%。结果显示采用3种品牌色谱柱所得木蝴蝶苷B峰位均能达到有效分离，其中采用Kromasil 100-5 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱所得木蝴蝶苷B峰理论塔板数较高、保留时间短，且峰形对称性好。