知母是百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根茎，味苦、甘，寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、滋阴润燥的功效^[1]。历版《中国药典》所收载的知母炮制方法均为盐炙法。本课题组在前期研究中以大鼠空腹血糖值、葡萄糖耐量、糖化血红蛋白为指标，发现知母盐炙后降血糖作用显著增强，并且对α-葡萄糖苷酶的抑制作用进行比较，发现盐知母可显著抑制α-葡萄糖苷酶活性^[2-3]。因此本实验借助Caco-2细胞研究生、盐知母对肠道葡萄糖吸收酶系的影响，在细胞水平上比较其降血糖作用，为寻找盐知母降血糖作用增强的炮制原理提供参考。

MCO-15AC型CO₂培养箱（日本三洋公司）；Mettler AE240型十万分之一分析天平（瑞士Mettler公司）；NIB-100倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；ZHJH-C1112B超净工作台（上海智成科学仪器有限公司）；Multiskan MK3酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Transwell细胞培养小室（Millicell公司，批号MCHT24H48）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯科学仪器有限公司）。

DMEM高糖培养基（批号1715848）、新生胎牛血清（批号1616964）、非必需氨基酸（MEM NEAA，批号1703183）、HBSS溶液（批号1694274）、胰蛋白酶（Trypsin-EDTA，批号1681700）、青链霉素双抗液（批号1697548）均购自Gibco公司；Hepes（北京索莱宝科技有限公司，批号513C0413）；CCK-8细胞活力试剂盒（批号20151214）、葡萄糖测试盒（批号20151105147）均购自南京建成生物工程研究所，口服葡萄糖（沈阳市试剂厂，批号20140718）， 蔗糖（批号20140110）、麦芽糖（批号20150605）购自天津科密欧化学试剂有限公司。

Caco-2人结肠癌细胞购自中国科学院细胞库；阿卡波糖片（拜耳医药保健有限公司，规格50 mg/片，批号BJ21783）、知母购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge 的干燥根茎，批号1510038

盐知母按前期研究确定的盐炙工艺制备^[2]。称取生、盐知母各10 g，分别加水150 mL，各煎煮2次，1 h/次，合并煎液，浓缩，冷冻干燥，得生、盐知母冻干粉3.22、3.25 g。精密称取冻干粉适量，分别加汉克平衡盐溶液（HBSS溶液，pH 7.3）制备成5 mg/mL的母液，备用。并用HBSS溶液分别稀释成5 000、2 500、500、250、50、25、5、2.5、0.5、0.25 μg/mL系列质量浓度的溶液。

在5% CO₂、37 ℃条件下，用正常培养基（CM培养基，含1%非必需氨基酸、1%青链酶素双抗、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基）培养Caco-2细胞。隔天换培养基，当细胞长满后进行传代。将处于对数生长期且状态良好的的Caco-2细胞按8×10⁴/mL接种到Transwell小室上，小室内加200 μL细胞悬液，小室外加1.3 mL CM培养基。最初2 d用CM培养基进行培养，之后用分化培养基（DM培养基，含2 mmol/L丁酸且不含血清培养基）进行培养，并分别于1、3、7 d用细胞电阻仪测定跨膜电阻，分析Caco-2单层细胞的完整性。在生长至第7天时测定细胞跨膜电阻（TEER）。当各孔TEER＞500 Ω/cm²，说明形成了致密的细胞单层。

选取对数生长期Caco-2细胞，采用CCK-8细胞活力试剂盒检测细胞毒性，来确定药物最大毒性剂量。将细胞密度调整为3×10⁴/mL，每孔100 μL接种于96孔培养板上，在CO₂培养箱中培养。24 h后进行分组，分为实验组和对照组，每组设4个复孔。实验孔每孔加入5 000、2 500、500、250、50、25、5、2.5、0.5、0.25 μg/mL生、盐知母水煎液10 μL，对照孔加入10 μL HBSS溶液。培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂后再培养4 h，用酶标仪测定450 mm处吸光度（A）值，计算细胞存活率（IC，IC＝A_实验/A_对照）^[6]。将98%的Caco-2细胞存活所对应的药物浓度（IC₉₈）作为最大毒性剂量。

药物均用含28 mmol/L蔗糖或麦芽糖为底物的无菌HBSS溶液溶解，滤过，使阿卡波糖质量浓度为250 μg/mL，实验组质量浓度为50、250 μg/mL（根据2.3项下结果选取50、250 μg/mL两个质量浓度），在已形成的Caco-2单层细胞的Transwell小室上进行。实验前移去小室中的培养液，用预热的HBSS液洗涤2次，每次在37 ℃，5% CO₂条件下培养20 min，除去细胞表面附着物。各组BL侧均加入1.5 mL空白的无菌HBSS。对照组AP侧加入0.5 mL空白的无菌HBSS；阴性对照组AP侧加入0.5 mL含蔗糖或麦芽糖底物的无菌HBSS；阿卡波糖组AP侧加入0.5 mL阿卡波糖溶液；生、盐知母组AP侧均加入不同质量浓度生、盐知母水煎液0.5 mL。混匀后置于5% CO₂、37 ℃培养箱中培养40 min，迅速从AP、BL侧吸出反应溶液，以蔗糖酶和麦芽糖酶底物，葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖质量浓度，计算抑制率^[7-10]。

抑制率=（C_阴性对照－C_样品）/（C_阴性对照－C_对照）

将药物用含葡萄糖0.55 mmol/L的无菌HBSS溶液溶解，过0.22 μm微孔滤膜。使阿卡波糖溶液质量浓度为250 μg/mL，同时将生、盐知母水煎液配制成质量浓度分别为50、250 μg/mL。吸净Caco-2单层细胞模型AP侧、BL侧培养液，再用HBSS冲洗3次，除去细胞表面附着物。同2.4项下对细胞进行分组。各实验组、对照组AP侧加入0.5 mL药物溶液或HBSS，BL侧均加入HBSS 1.5 mL。置5% CO₂、37 ℃培养箱中培养40 min，迅速从AP侧中吸出反应溶液，葡萄糖吸收实验测定剩余葡萄糖的质量浓度，计算葡萄糖被吸收的量^[10-11]。

所有数据均以x ± s表示，应用SPSS 19.0统计软件，各组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。

当生、盐知母质量浓度≤250 μg/mL时，Caco-2细胞IC值大于98%，在此浓度范围内可进行细胞实验，结果见表 1。实验选取了50、250 μg/mL两个质量浓度。

表 1(Table 1)

表 1 生、盐知母水煎液对Caco-2细胞细胞存活率的影响（x ± s，n =4） Table 1 Effects of Anemarrhena Rhizoma and salt Anemarrhena Rhizomadecoction on cell survival rates of Caco-2 cell (x ± s,n = 4) 组别 质量浓度/(μg·mL-1) IC/% 生知母 0.25 98.51±2.21 0.5 98.93±1.54 2.5 98.51±2.45 5 98.62±0.37 25 99.25±2.13 50 99.73±1.27 250 99.98±2.07 500 95.23±1.47 2 500 89.45±1.53 5 000 90.22±2.32 盐知母 0.25 98.24±1.37 0.5 98.42±0.97 2.5 98.64±1.87 5 99.43±1.77 25 98.91±1.49 50 99.11±2.35 250 99.87±1.58 500 95.44±0.58 2 500 93.53±2.14 5 000 92.74±0.97

表 1 生、盐知母水煎液对Caco-2细胞细胞存活率的影响（x ± s，n =4） Table 1 Effects of Anemarrhena Rhizoma and salt Anemarrhena Rhizomadecoction on cell survival rates of Caco-2 cell (x ± s,n = 4)

生、盐知母水煎液对蔗糖酶、麦芽糖酶活性均有抑制作用，使AP侧和BL侧游离葡萄糖减少。且盐知母水煎液对蔗糖酶、麦芽糖酶的抑制作用均优于生知母。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 生、盐知母水煎液对Caco-2细胞上蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制率（x ± s，n =4） Table 2 Inhibition of Anemarrhena Rhizoma and salt Anemarrhena Rhizoma to sucrose and maltase on Caco-2 cell (x ± s,n = 4) 组别 质量浓度/(μg·mL-1) 以蔗糖计抑制率/% 以麦芽糖计抑制率/% AP侧 BL侧 AP侧 BL侧 阿卡波糖 250 72.20±2.33 74.37±1.47 77.19±2.87 79.96±1.32 生知母 50 51.56±3.44 58.47±1.37 42.25±2.31 44.38±3.11 250 55.54±2.67 60.08±3.12 49.99±2.77 49.62±3.31 盐知母 50 54.65±4.23 59.27±0.78 51.94±2.45 53.11±2.12 250 69.17±3.11 67.26±2.14 64.95±2.37 65.46±0.97

表 2 生、盐知母水煎液对Caco-2细胞上蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制率（x ± s，n =4） Table 2 Inhibition of Anemarrhena Rhizoma and salt Anemarrhena Rhizoma to sucrose and maltase on Caco-2 cell (x ± s,n = 4)

以葡萄糖为糖原，与对照组比较，阿卡波糖略有此作用（P＜0.05），生、盐知母水煎液均有降低细胞对葡萄糖吸收的趋势，且呈现剂量相关性，但效果不显著。盐知母水煎液对葡萄糖吸收的抑制作用略好于生知母（P＜0.05）。结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 生、盐知母水煎液对Caco-2细胞吸收和转运葡萄糖的影响（x ± s，n =4） Table 3 Effects of Anemarrhena Rhizoma and salt Anemarrhena Rhizoma to glucose uptake and transport on Caco-2 cells (x ± s,n = 4) 组别 质量浓度/(μg·mL-1) 葡萄糖/(mmol·L-1) 对照 — 5.73±0.74 阿卡波糖 250 4.98±0.28* 生知母 50 5.64±0.45 250 5.34±0.17 盐知母 50 5.21±0.27 250 4.92±0.32*  与对照组比较： *P＜0.05  *P< 0.05 vs control group

表 3 生、盐知母水煎液对Caco-2细胞吸收和转运葡萄糖的影响（x ± s，n =4） Table 3 Effects of Anemarrhena Rhizoma and salt Anemarrhena Rhizoma to glucose uptake and transport on Caco-2 cells (x ± s,n = 4)

Caco-2细胞来源于人的结肠癌细胞，培养时能自发地进行类似人类肠道细胞的分化，具备小肠的微绒毛结构以及多种小肠吸收的特性，表现出与人小肠上皮细胞相似的糖消化吸收和葡萄糖异生相关酶类^[12]。人们饮食结构中主要成分为淀粉，蔗糖酶和麦芽糖酶在淀粉消化成可被吸收的单糖过程中发挥主要作用。故本实验以Caco-2细胞为模型，以蔗糖、麦芽糖为底物来研究生、盐知母水煎液对α-葡萄糖苷酶、葡萄糖吸收活性的影响。同时以葡萄糖为糖原研究生、盐知母水煎液对葡萄糖转运蛋白的影响。

实验结果表明，生、盐知母水煎液可以有效地抑制Caco-2细胞单层模型上二糖酶的活力，且盐知母水煎液的抑制活性高于生知母，这与前期研究知母盐炙前后对α-葡萄糖苷酶作用比较结果相一致。此外，以葡萄糖为糖原时，生、盐知母水煎液均可降低葡萄糖的吸收作用，但效果不显著。推测盐知母水煎液降糖机制可能主要体现在α-葡萄糖苷酶上，而对葡萄糖吸收作用影响较小。提示盐知母降血糖作用可能与抑制二糖酶活力，对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用有关。