依维莫司是免疫抑制剂西罗莫司C₄₂位丙酸酯类衍生物，结构式见图 1。由诺华公司研发，临床上主要用于预防心脏移植和肾移植手术后的排异反应^[1]。依维莫司也是一种mTOR激酶抑制剂，可阻断细胞周期从G1期到S期进程，导致癌细胞死亡，2009年FDA批准其用于治疗使用舒尼替尼或索拉非尼无效的晚期肾癌^[2]。另外依维莫司还具有抑制血管内皮细胞增殖的作用，用作药物支架的涂层药物可防止冠状动脉支架植入后血管再狭窄^[3]。本实验建立反相高效液相色谱法测定依维莫司原料药中依维莫司，该方法操作简便，专属性强，为依维莫司原料药的质量控制提供了准确可行的分析方法。

图 1 依维莫司的结构式Fig. 1 Structure of everolimus

Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent色谱工作站；CPA225D型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

依维莫司原料药（武汉贝尔卡生物医药有限公司），依维莫司对照品（质量分数99%，Aladdin），甲醇（色谱纯，Fisher公司）、乙腈（色谱纯，Fisher公司），其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

Hypersil-ODS C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（70∶30）；检测波长：276 nm；柱温：50 ℃；体积流量：0.8 mL/min；进样量：10 μL。

取依维莫司原料10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用流动相乙腈-水（70∶30）溶解并加至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取依维莫司对照品10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用流动相乙腈-水（70∶30）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

取供试品溶液适量，分别经2 mol/mL硫酸溶液（室温放置1 h）、2 mol/L氢氧钠溶液（室温放置1 h）、10%过氧化氢溶液（室温放置1 h）、80 ℃高温1 h进行破坏。精密量取上述溶液分别注入色谱仪，记录色谱图。结果表明，依维莫司经酸、碱、氧化、高温破坏，所产生的降解产物与主成分均能完全分离，不干扰依维莫司的测定。色谱图见图 2。

*-依维莫司 *-everolimus图 2 酸破坏试验（A）、碱破坏试验（B）、氧化破坏试验（C）和高温破坏试验（D）的HPLC图谱Fig. 2 HPLC chromatograms of destroyed by acid (A), destroyed by alkali (B), destroyed by oxidation (C), and destroyed by heating (D)

称取依维莫司对照品10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀后作为标准贮备液。分别精密量取储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，置10 mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度。进样测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合，得回归方程为Y=32.123 X＋183.27，r＝0.999 7，结果表明，依维莫司在63～1 008 μg/mL线性关系良好。

取批号140528依维莫司样品，制备供试品溶液，精密量取20 μL，重复进样6次，结果依维莫司峰面积的RSD值为0.7%。

取批号140528依维莫司样品适量，制备供试品溶液，于室温（20～25 ℃）下放置，分别于0、2、4、6、8、10 h分别进样测定，记录主峰面积，结果依维莫司峰面积的RSD值为0.52%，说明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

取批号140528依维莫司样品6份，制备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积，计算依维莫司的质量分数，结果其RSD值为0.58%。

精密称取批号140528依维莫司样品40 mg，置于100 mL量瓶中，共9份，分别加入依维莫司对照品32.03、39.95、45.77 mg，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果平均回收率为100.45%，RSD值为0.64%（n＝9）。

取依维莫司原料药约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀。再精密量取2 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。取上述溶液10 μL进行测定；另精密称取105 ℃干燥至恒定质量的依维莫司对照品适量，同法测定作为对照，按外标法计算依维莫司的质量分数，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 依维莫司原料药中依维莫司的测定结果（n=3）Table 1 Determination of everolimus in everolimus active pharmaceutical ingredient (n=3) 批 号 依维莫司/% RSD/% 140415 99.5 0.93 140528 98.9 1.70 140607 98.5 1.30 140630 99.8 0.67 140720 99.6 0.45 140731 98.0 1.30

表 1 依维莫司原料药中依维莫司的测定结果（n=3）Table 1 Determination of everolimus in everolimus active pharmaceutical ingredient (n=3)

取依维莫司适量，加流动相稀释至适宜浓度，以流动相为空白样品，在190～400 nm波长进行扫描。结果依维莫司在276 nm处有最大吸收，而空白样品无吸收，故选择276 nm作为检测波长。

参考同类化合物的检测方法^[4]，对流动相进行筛选。根据试验结果，确定用乙腈和水为流动相，所得依维莫司峰形较好，且主峰保留时间适宜。

综上所述，本实验建立了利用高效液相色谱法测定依维莫司的方法，方法学研究表明利用该方法测定依维莫司保留时间稳定，方法精密度高，结果准确，是一种较理想的测定方法，为依维莫司质量控制标准的建立提供参考。