脑胶质瘤是一类神经系统最常见的颅内肿瘤，在临床上主要是以手术治疗及放化疗为主^[1]。但即使是进行了手术及放化疗，术后3年生存率也不足5%^[2]，这使得明确其发病机制并寻找有效抑制胶质瘤的药物变得非常具有临床意义^[3]。长期的放化疗对胶质瘤患者的伤害也是巨大的，所以寻找一种能有效杀死胶质瘤细胞，并且降低毒性以改善患者生存质量的药物有极大的临床意义。小白菊内酯是从艾菊Tanacetum vulgare Linn.中提取的一种倍半萜烯内酯化合物，实验证实小白菊内酯是艾菊中药理活性最好的成分之一^[4]。有研究证实小白菊内酯可抑制肝癌、肠癌等多种肿瘤的增殖，并对其细胞周期也有一定的影响^[5]。本研究以人脑恶性胶质瘤细胞系U-87 MG为研究模型，对其进行小白菊内酯的药物处理，研究了小白菊内酯对恶性胶质瘤的增殖、细胞周期细胞凋亡的影响及初步的分子机制研究，探讨小白菊内酯辅助治疗恶性胶质瘤的可行性。

人脑恶性胶质瘤细胞系U-87 MG购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。小白菊内酯（质量分数＞99.0%）由上海锐谷生物科技有限公司提供。DMEM（HighGlycose）培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素双抗溶液（PS）及0.25%胰蛋白酶均采购自美国HyClone公司。Cell Counting Kit 8（CCK 8试剂盒）购自北京索莱宝科技有限公司。碘化丙啶（PI）、二甲基亚砜采购自美国Sigma公司。结晶紫染色液购自上海碧云天生物科技有限公司。SYBRGreen 2×Mix、qPCR引物均购自宝生物（大连）工程有限公司。抗体（兔抗P53、Caspase3、Bax及P53-Ser³⁹²磷酸化）、PVDF膜、ECL试剂盒采购自美国Millipore公司。引物由宝生物（大连）工程有限公司定制合成。依托泊苷注射液（5mL∶100 mg，批号90140301）购自四川升和药业股份有限公司。

37 ℃、5% CO₂培养箱由美国赛默飞公司生产，荧光显微镜为日本Olympus公司产品。EL-312E酶联免疫检测仪为美国Bio-Tek公司产品。FACScalibur流式细胞仪为美国BD公司生产。SYBR Green 2×Mix、CFX-96荧光定量PCR仪由美国Bio-Rad公司生产，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。电泳仪垂直电泳槽采购自北京六一仪器厂。

2.1 小白菊内酯溶液的配制

2.1.1 贮存液的配制

称取2.48 mg小白菊内酯粉剂，吸取1 mL DMSO与小白菊内酯粉剂混合，使用移液器反复吹打至完全溶解，继而加入无抗生素的DMEM配制成10mmol/L贮存液，0.22 μm滤器滤过除菌。

采用无抗生素的DMEM培养基将贮存液稀释为10、20 μmol/L工作液。

人脑恶性胶质瘤细胞株U-87 MG经复后传代培养，使用DMEM＋10%FBS＋1% PS培养基，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，实验用细胞均处于对数生长期。

取对数生长期的U-87 MG细胞，消化后细胞计数，稀释至浓度为3×10⁵/mL，进行96孔板铺板，每孔加液量100 μL，12 h后换液。在孔内加入小白菊内酯工作液，按照不同浓度进行稀释，并取10μL分别加入各个孔中，使终浓度分别为1、10、20、50、100 μmol/L，每种浓度各设3个复孔。设对照组，由于溶剂为DMSO，故对照组细胞加入10 μL DMSO处理，阳性组为50 μmol/L依托泊苷处理，同样对照组、阳性组也各设5个复孔。培养48 h后，加入CCK8（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h后，每孔加入0.1 mol/L HCl溶液10 μL，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h内在EL-312E酶标仪上选择波长450 nm，读出每孔的吸光度（A）值，并进行统计。计算药物抑制率，利用概率单位法计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

抑制率＝[A（对照）－A（加药）]/A（对照）

取对数生长期的U-87 MG细胞，消化后细胞计数，6孔板铺板，每孔加细胞数200个，12h后待细胞贴壁，将培养基换成含有IC₅₀浓度（36 μmol/L）、100 μmol/L小白菊内酯以及对照组的培养基，各3个复孔。药物作用48 h后弃去含有药物的培养基，换为2 mL普通培养基，培养7 d。弃去培养基，4%多聚甲醛固定后，结晶紫染液染色，对克隆计数，计算单个克隆形成集落大小。

将U-87 MG细胞在六孔板中铺板，每孔1×10⁵个细胞，将细胞分组为IC₅₀浓度（36 μmol/L）、100 μmol/L小白菊内酯处理及对照组，每组设3个复孔。培养12 h后，按照分组加入小白菊内酯，继续培养48 h后，收集样本，70%乙醇固定，PI染色，并进行流式细胞仪检测。

取IC₅₀浓度（36 μmol/L）、100 μmol/L小白菊内酯处理48 h后的U-87MG细胞，以及对照组，裂解细胞提取RNA进行反转录，使用SYBR Green 2×Mix进行qPCR。扩增条件为：95 ℃、5 min；95 ℃、5 s；60 ℃、10 s，并读取荧光，；第2～3步循环45次。引物见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 qPCR引物序列 Table 1 qPCRprimer 名称 引物序列 Bax F GCGTCCACCAAGAAGC Bax R CGGCGGCAATCATCC Caspase3 F ACCTGTGGCTGTGTATC Caspase3 R GGCTCGCTAACTCCTC Cyclin D1 F CTGCTCCTGGTGAACAAG Cyclin D1 R TCTCCTCCGCCTCTGG β-Actin F TCGGCGGCTCCATCCTG β-Actin R ACTCGTCATACTCCTGCTTGC

表 1 qPCR引物序列 Table 1 qPCRprimer

取IC₅₀浓度（36 μmol/L）、100 μmol/L小白菊内酯处理48 h后的U-87 MG细胞，以及对照组，裂解细胞提取蛋白质，利用Lowry法测定总蛋白浓度，以每个泳道20 μg蛋白样品上样，经30%变性SDS-PAGE电泳后，经电转至PVDF膜上。封闭后，分别检测Bax、Caspase 3、P5P53-Ser³⁹²、GAPDH，按顺序加上一抗（1∶1 000）、二抗（1∶5 000）进行杂交，ECL发光试剂盒进行显色，检测杂交信号。

实验数据以x ± s表示，使用SPSS 12.0统计软件进行ANOVA单因素方差分析。

3.1 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞增殖的抑制作用

不同浓度药物与细胞共同培养48 h之后，发现1、10、20、50、100 μmol/L小白菊内酯处理U-87 MG细胞48 h后的增殖抑制率和依托泊苷处理的细胞增殖抑制率均远远大于对照组（P＜0.01），并且白菊内酯对于U-87 MG细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量相关性。小白菊内酯处理U-87MG细胞48 h的IC₅₀为（35.89±2.2）μmol/L，因此选择IC₅₀浓度为36 μmol/L。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 表 2 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞增殖的抑制作用（x ± s，n=5 ） Table 1 Effects ofparthenolide with variousconcentrations on growth inhibition of U-87 MG (x ± s, n = 5 ) 组 别 浓度/(μmol·L−1) 抑制率/% 对照 0 2.85±1.21 小白菊内酯 1 8.92±3.12 10 28.89±4.29 20 40.68±5.92** 50 56.32±2.32** 100 68.75±3.12** 依托泊苷 50 87.45±2.60** 与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01 sup>*P＜0.05**P＜0.01 vs control group

表 2 表 2 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞增殖的抑制作用（x ± s，n=5 ） Table 2 Effects ofparthenolide with variousconcentrations on growth inhibition of U-87 MG (x ± s, n = 5 )

IC₅₀浓度（36 μmol/L）、100 μmol/L小白菊内酯处理后的U-87 MG细胞克隆形成的大小及数目均明显低于对照组，见图 1。克隆形成数统计结果也表明小白菊内酯可明显抑制人脑恶性胶质瘤U-87MG的集落形成率，见表 3。

图 1 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG克隆形成的影响Fig. 1 Effect of parthenolide onthe clone formation of U-87 MG cells

表 3(Table 3)

表 3 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG克隆形成数的影响（x ± s，n=5） Table 1 Number ofcolony formations of U-87 MG cells treated by parthenolide with various concentrations (x ± s, n = 5) 组 别 浓度/(μmol·L−1) 克隆形成数/个 对照 0 150.33±8.08 小白菊内酯 36 53.67±2.52** 100 28.33±5.51** 与对照组比较：**P＜0.01 **P <0.01 vs control group

表 3 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG克隆形成数的影响（x ± s，n=5） Table 3 Number ofcolony formations of U-87 MG cells treated by parthenolide with various concentrations (x ± s, n = 5)

PI单染流式细胞仪检测结果显示，经36 μmol/L小白菊内酯处理48 h后，U-87 MG细胞的S期、G2/M期的细胞比例明显降低，即小白菊内酯使得U-87 MG细胞的S期及G2/M期受到了阻滞，见表 4。同时，G0/G1期细胞比例明显降低，随着浓度增加，这种趋势愈加增强。同时经36、100 μmol/L小白菊内酯处理后U-87 MG细胞的凋亡（Sub-G1）也明显增多，见表 5。

表 4(Table 4)

表 4 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞周期的影响（x ± s，n=3） Table 1 Effects of parthenolide with variousconcentrations on cell cycle distribution of U-87 MG cells (x ± s, n = 3) 组 别 浓度/(μmol·L−1) G0/G1/% S/% G2/M/% sub-G1/% 对照 0 57.57±0.85 29.24±0.33 15.20±0.75 5.16±0.31 小白菊内酯 36 76.45±0.34** 17.56±1.09** 6.60±1.07 14.89±1.07** 100 78.57±0.95** 19.24±0.60 5.20±0.51 12.92±0.04 与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01 *P <0.05 **P <0.01 vscontrol group

表 4 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞周期的影响（x ± s，n=3） Table 4 Effects of parthenolide with variousconcentrations on cell cycle distribution of U-87 MG cells (x ± s, n = 3)

表 5(Table 5)

表 5 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞凋亡的影响 （x ± s，n=3） Table 1 Effects of parthenolide with various concentrations on apoptosis of U-87 MG cells (x ± s, n = 3) 组 别 浓度/(μmol·L−1) 凋亡率/% 对照 0 5.16±0.31 小白菊内酯 36 14.89±1.07** 100 12.92±0.04 与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01 *P<0.05 **P <0.01 vs control group

表 5 不同浓度小白菊内酯对U-87 MG细胞凋亡的影响 （x ± s，n=3） Table 5 Effects of parthenolide with various concentrations on apoptosis of U-87 MG cells (x ± s, n = 3)

荧光定量PCR检测不同浓度的小白菊内酯处理后的U-87 MG细胞的凋亡相关基因Bax、Caspase3及Cyclin D1基因的mRNA水平表达。结果显示，U-87 MG细胞经小白菊内酯处理48 h后，可明显上调Bax基因及Caspase3基因的mRNA表达水平，同时Cyclin D1基因的mRNA表达水平明显下降。见表 6。

表 6(Table 6)

表 6 小白菊内酯对U-87 MG细胞凋亡相关基因mRNA表达变化的影响（x ± s，n=3） Table 6 Apoptosis gene mRNAexpression of U-87 MG cells treated by parthenolide (x ± s, n=3) 组 别 浓度/(μmol·L−1) 2−∆∆Ct Bax Caspase3 Cyclin D1 对照 0 1.03±0.32 1.07±0.63 1.02±0.11 小白菊内酯 36 1.99±0.19** 1.82±0.20** 0.75±0.06 100 2.32±0.06** 2.12±0.22** 0.61±0.23 与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01 *P <0.05 **P <0.01 vscontrol group

表 6 小白菊内酯对U-87 MG细胞凋亡相关基因mRNA表达变化的影响（x ± s，n=3） Table 6 Apoptosis gene mRNAexpression of U-87 MG cells treated by parthenolide (x ± s, n=3)

用Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白，结果与qPCR结果相互应证，即U-87 MG细胞经小白菊内酯处理48 h后，可明显上调Bax及Caspase3基因的蛋白表达水平，同时CyclinD1基因的蛋白表达水平明显下降。有一定的剂量效应，见图 2。U-87MG细胞经小白菊内酯处理48 h后，用Western blotting法检测P53及P53-Ser³⁹²残基的磷酸化，结果表明小白菊内酯处理后可明显促进P53-Ser³⁹²的蛋白质磷酸化，见图 3。

图 2 小白菊内酯对U-87 MG细胞凋亡及细胞周期相关基因蛋白表达变化影响Fig. 2 Effects of parthenolide on apoptosisand cell cycle gene expression of U-87 MG cells

图 3 小白菊内酯对U-87 MG细胞凋亡及细胞周期相关基因P53-Ser392磷酸化变化影响Fig. 3 Effects of parthenolide on apoptosisgene protean expression andP53-Ser392 phosphorylationof U-87 MG cells

恶性胶质瘤是最常见的颅内肿瘤之一，国内16个单位统计资料表明神经胶质瘤占颅内肿瘤的44.6%，欧洲报道的发生率占颅内肿瘤的36.0%～50.1%^[6]。人脑胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，是人类最恶性最具侵袭性的肿瘤之一，其中恶性胶质瘤约占60%，即使联合手术、放疗和化疗，其中位生存期也只有9～12月，几十年来，尽管尝试各种改进的治疗方案，恶性胶质瘤生存期仍没有明显的提高^[7]。

小白菊内酯已经显示出显著抑制肿瘤能力。研究表明，同时使用小白菊内酯与舒林酸时，对胰腺癌具有细胞增殖的影响的协同抑制作用^[8]。与此同时，另一项研究表明，小白菊内酯在多发性骨髓瘤细胞增殖上起到了抑制的作用^[9]。

在本研究中，通过对CCK8的增殖和集落形成能力的研究，发现小白菊内酯处理后对人类神经胶质瘤细胞系U-87 MG有着显著的抑制作用。经过小白菊内酯处理48 h后，U-87MG细胞的增殖能力，以及集落形成能力都明显受到抑制。在同一时间内，有着明显的抑制药浓度和处理时间相关性，即小白菊内酯的浓度越高，或更长的处理时间，其对肿瘤生长抑制更明显。流式细胞仪检测发现，小白菊内酯为人类恶性神经胶质瘤细胞的U-87 MG细胞周期的变化也可以在细胞的S期、G2/M期以及G0/G1期起到了相当显著的效果，小白菊内酯处理48 h后，U-87 MG细胞的S期及G2/M期显著下降，与此同时细胞的G0/G1期显著增加，而显示凋亡细胞的Sub-G1期也有着显著的增加。这表明，随着处理U-87 MG细胞的PAR浓度增加，细胞周期在G0/G1期的停滞，同时也伴随着G2/M期以及S期的细胞比例显著降低。这些结果表明，小白菊内酯作用在U-87MG细胞中，将细胞阻滞在G0/G1期，细胞不能合成DNA，因此通过阻滞了有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。增加的Sub-G1峰，说明在小白菊内酯的作用下，U-87 MG细胞周期受到了阻断，同时也伴随着大量的细胞凋亡。

为了探究小白菊内酯对肿瘤细胞增殖的抑制，及细胞周期的变化，实验首先检测了小白菊内酯处理后的U-87 MG细胞的mRNA表达变化。发现经过小白菊内酯的处理后，U-87 MG细胞内的Caspase 3以及Bax基因的mRNA表达量明显增高，同时Cyclin D1基因表达明显下降。为了验证这个表达，继而通过Westernblotting法检测了Caspase3、Bax以及Cyclin D1基因的蛋白表达水平。结果表明确实在小白菊内酯处理后，Caspase3、Bax的蛋白表达水平明显升高，而Cyclin D1表达明显降低。这说明了小白菊内酯对于U-87 MG细胞的细胞凋亡影响可能是通过上调Caspase 9以及Bax基因起作用的，而细胞周期的阻滞可能是受到了Cyclin D1的影响。

同时，对P53基因的磷酸化研究发现，加入小白菊内酯后，P53基因的Ser³⁹²位点磷酸化增强，而P53基因作为Bax、Caspase 3等基因的上游，其磷酸化可能就是促进这些基因表达的关键原因。

当细胞及DNA受到一定的损伤之后，如紫外辐射或电离辐射伤害，或依托泊苷、nutlin-3等伤害后，可以检测到P53的Ser³⁹²的残基产生磷酸化^[10]，这表明P53-Ser³⁹²这个残基可能会受到药物影响而产生，并进一步激活下游基因的表达。P53基因的Ser³⁹²位点残基的磷酸化，可激活下游大量靶基因，如P21、Bax等^[11]。

Bax、Bcl-2基因是两种重要的细胞凋亡调节基因，高表达的Bcl-2可以与Bax形成异二聚体从而抑制细胞凋亡，高表达的Bax蛋白会与自身形成同源二聚体，从而促进细胞凋亡^[12]。有研究表明，所有促进或抑制细胞凋亡的细胞凋亡的基因，最终归结到Bax蛋白的表达量增加^[13]。

Bax在线粒体外膜表面，主要是允许跨线粒体膜的CYT-c进入细胞质，从而导致细胞凋亡。进入CYT-c和凋亡酶激活因子1细胞质（APAF-1）会相互结合，同时将APAF-1激活，然后再结合辅助因子dATP/ATPAPA构成了凋亡小体，在凋亡小体上的APAF-1会招募Procaspase-9在凋亡小体上形成低聚物，使得Procaspase-9发生同源活化^[14]，活化的Caspase 9便更进一步激活下游的Caspase 3，继而激活Caspase 6、7从而促进细胞活化凋亡^[15]。他们会通过一系列的激活下游基因，来发挥调控细胞凋亡的功能。

Cyclin D1是在细胞周期调控细胞周期G1期的调节的关键蛋白质，是必不可少一个环节的。研究发现^[16]，细胞周期调控的关键蛋白质CyclinD1已被确认为一种原癌基因，Cyclin D1的过度表达会导致细胞G1期的阻滞，所以它在细胞周期调控中起着非常重要的作用。P53基因的磷酸化激活后，会激活下游基因P21的转录表达，而P21作为Cyclin D1的抑制基因，可以对Cyclin D1与CDK复合物的形成加以抑制，从而使得细胞周期于G1期受到阻滞，进一步导致细胞凋亡^[17]。

综上所述，小白菊内酯可能是通过对肿瘤细胞的损伤，激活了P53的Ser³⁹²残基的磷酸化。从而激活了Bax以及Caspase 9基因的高表达，激活了肿瘤细胞的线粒体凋亡途径，抑制了细胞的增殖以及克隆形成能力。同时磷酸化激活的P53基因，通过抑制了Cyclin D1基因的表达，从而引起了U-87 MG细胞周期被阻滞在了G1期，继而进一步引起了大量的肿瘤细胞凋亡。