2015, Vol. 30
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-5515.2015.03.007 |
脑血栓片是临床治疗中风和脑血栓的常用中成药，由丹参、红花、桃仁、赤芍等10味中药组成，具有活血化瘀、醒脑通络、潜阳熄风的功效，用于因瘀血、肝阳上亢出现的中风先兆，如肢体麻木、头晕目眩等和脑血栓形成出现的中风不语、口眼歪斜、半身不遂等症，具有预防和治疗作用。天津同仁堂集团股份有限公司生产的薄膜衣片药品执行标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ04962004，标准中均无定量指标，无法有效地控制药品的质量。处方中红花、桃仁、赤芍具有通经活络的功效，丹参、当归具有祛瘀生新的功效，均为臣药，因此本研究建立DAD-HPLC法同时测定脑血栓片中上述中药的主要有效成分苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和丹参酮ⅡA，对控制和提高脑血栓片的质量有重要的意义。
1 仪器与试药Waters e2695高效液相色谱仪，配有四元泵、2998二极管阵列紫外检测器、自动进样器、empower色谱工作站。
苦杏仁苷（质量分数93.6%，批号110820- 201004）、羟基红花黄色素A（质量分数92.5%，批号111637-201106）、芍药苷（质量分数96.5%，批号110736-201035）、阿魏酸（质量分数99.6%，批号110773-201012）、丹酚酸B（质量分数95.4%，批号111562-201212）和丹参酮ⅡA（批号110766- 200619）对照品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，购于默克公司；水为超纯水。
脑血栓片为天津同仁堂集团股份有限公司生产，薄膜衣片，规格为0.6 g/片，批号分别为C90023、D86004、B83006。
2 方法与结果 2.1 色谱条件Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～25 min，15% A→50% A，25～30 min，50% A→70% A，30～37 min，70% A→90% A，37～38 min，90% A→15% A，38～55 min，15% A；检测波长分别为210 nm（苦杏仁苷）、403 nm（羟基红花黄色素A）、230 nm（芍药苷）、321 nm（阿魏酸）、286 nm（丹酚酸B）、270 nm（丹参酮ⅡA）；体积流量：0.7 mL/min；柱温：30 ℃；进样量3～5 μL。
2.2 对照品溶液的制备分别精密称取苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成分别含70、1、230、3、40、2 μg/mL的混合对照品溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取0.2 g，置离心管中，加入甲醇50 mL，超声处理30 min，3 000 r/min离心5 min，残渣加甲醇重复提取2次，每次25 mL，分别取上清液，置圆底烧瓶中，40 ℃减压浓缩至约1～2 mL，用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 专属性试验按处方比例分别制备缺桃仁、红花、赤芍、当归和川芎以及丹参的阴性样品，制备成阴性样品溶液。分别取上述对照品溶液5 μL、脑血栓片供试品溶液及阴性样品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图 1～6。
 | 1-苦杏仁苷 1- amygdalin图 1 缺桃仁阴性样品（A）、苦杏仁苷对照品（B）和脑血栓片（C）的HPLC色谱图Fig. 1 HPLC chromatograms of negative sample without Persicae Semen (A),amygdalin reference substance (B),and Naoxueshuan Tablets (C) |
 | 2-羟基红花黄色素A 2-hydroxysafflor yellow A 图 2 缺红花阴性样品（A）、羟基红花黄色素A对照品（B）和脑血栓片（C）的HPLC色谱图Fig. 2 PLC chromatograms of negative sample without Carthami Flos (A),hydroxysafflor yellow A reference substance (B),and Naoxueshuan Tablets (C) |
 | 3-芍药苷 3- paeoniflorin图 3 缺赤芍阴性样品（A）、芍药苷对照品（B）和脑血栓片（C）的HPLC色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms of negative sample without Paeoniae Rubra Radix (A),paeoniflorin reference substance (B),and Naoxueshuan Tablets (C) |
 | 4-阿魏酸 4- ferulic acid图 4 缺当归、川芎阴性样品（A）、阿魏酸对照品（B）和脑血栓片（C）的HPLC色谱图Fig. 4 HPLC chromatograms of negative sample without Angelicae Sinensis Radix andChuanxiong Rhizoma (A),ferulic acid reference substance (B),and Naoxueshuan Tablets (C) |
 | 5-丹酚酸B 5-salvianolic acid B图 5 缺丹参阴性样品（A）、丹酚酸B对照品（B）和脑血栓片（C）的HPLC色谱图Fig. 5 HPLC chromatograms of negative sample without Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (A),salvianolic acid B reference substance (B),and Naoxueshuan Tablets (C) |
 | 6-丹参酮ⅡA 6-tanshinoneⅡA图 6 缺丹参阴性样品（A）、丹参酮ⅡA对照品（B）和脑血栓片（C）的HPLC色谱图Fig. 6 HPLC chromatograms of negative sample without Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (A),tanshinone ⅡA reference substance (B),and Naoxueshuan Tablets (C) |
精密称取苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.237 2、0.0182 8、0.234 5、0.202 2、0.198 4、0.110 2 mg/mL的混合对照品储备溶液。分别精密吸取上述溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述稀释后对照品溶液及储备液各5 μL，进样，按上述色谱条件测定峰面积。以进样质量对峰面积值进行线性回归，得回归方程，见表 1。
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表 1 苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的线性方程 Table 1 Linear regressions of amygdalin,hydroxylsafflor yellow A,paeoniflorin,ferulic acid,salvianolic acid B,and tanshinone ⅡA |
取批号B83006血栓片样品0.2 g，制备供试品溶液，进样测定，结果样品中苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的峰面积RSD值分别为1.92%、2.23%、1.99%、2.04%、1.81%、1.79%。
2.7 重复性试验取批号B83006脑血栓片样品0.2 g，平行精密称取6份，制备供试品溶液，依法测定，计算，结果苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA质量分数分别为5.893 6、0.096 7、9.691 9、0.233 9、3.536 7、0.166 3 mg/g，RSD值分别为0.65%、1.18%、1.09%、0.48%、0.90%、0.67%。
2.8 稳定性试验取批号B83006脑血栓片样品0.2 g，制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18、24 h进样测定，结果样品中苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为1.90%、1.93%、1.32%、1.93%、1.62%、1.89%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.9 回收率试验取批号B83006脑血栓片样品6份，每份0.1 g，精密称定，分别精密加入含苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA 11.64、0.186、19.84、0.46、7.1、0.32 μg/mL混合对照品溶液50 mL，制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算回收率。结果各成分的平均回收率分别为96.47%、96.92%、99.96%、97.20%、97.57%、96.50%，RSD值分别为1.3%、1.6%、1.3%、1.7%、1.9%、0.7%。
2.10 样品测定取3批脑血栓片样品，制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，按外标法计算质量分数。结果见表 2。
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表 2 脑血栓片中苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的测定结果（n=3） Table 2 Determination of amygdalin,hydroxysafflor yellow A,paeoniflorin,ferulic acid,salvianolic acid B,and tanshinone ⅡA in Naoxueshuan Tablets (n = 3 ) |
采用规格为100 mm×4.6 mm，粒径为2.7 μm的色谱柱，与常规的粒径为5 μm色谱柱比较，提高了分离效果，减少了分析时间，节约了有机溶剂，极大地提高了工作效率；同时由于可以在普通液相色谱仪器上使用，粒径为2.7 μm的色谱柱具有非常大的应用前景。
3.2 提取方法考察分别采用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇作为提取溶剂，比较加热回流和超声处理两种提取方法，并对提取溶剂用量和提取时间进行考察，结果表明加入甲醇50、25、25 mL超声提取，可将样品中6种成方提取完全。
3.3 流动相的选择苦杏仁苷与其他成分的分离是实验中的难点，经参考文献[1, 2]比较2种流动相体系：（1）以乙腈-0.2%磷酸进行梯度洗脱，结果样品色谱中部分色谱峰与杂质峰分离较差[3, 4]；（2）采用甲醇-0.2%磷酸为流动相，结果品色谱中苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA色谱峰与杂质峰分离效果较好，分离度均大于1.5，效果较好。
3.4 检测波长的确定苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的最大吸收波长从210 nm至403 nm，相差极大，因此本实验分析时采用Waters 2998二极管阵列检测器，设定相关成分的最大吸收波长作为检测波长：210 nm（苦杏仁苷）、403 nm（羟基红花黄色素A）、230 nm（芍药苷）、321 nm（阿魏酸）、286 nm（丹酚酸B）、270 nm（丹参酮ⅡA），达到最佳的分析效果。
3.5 柱温的选择比较30、35、40 ℃不同柱温条件下样品的分离情况，结果以柱温为30 ℃时样品分离较好。
3.6 进样量的影响实验发现，当供试品溶液进样量为5 μL时，样品色谱图中大部分色谱峰峰形较差，出现肩峰；经调整进样量，减小为3 μL或更小时，峰形较好。分析原因为粒径为2.7 μm的色谱柱承载量较5 μm色谱柱小，应该减小进样量，避免色谱柱超载。
3.7 耐用性试验采用Waters e2695高效液相色谱仪，分别以Agilent Porlshell 120 SB- C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Kinetex C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）对3批血栓片样品的供试品溶液进行测定，计算样品中丹6种成分。结果不同色谱柱测定样品的结果基本一致。
3.8 检测指标的确定文献报道中采用HPLC法测定脑血栓片中丹参素等5种成分的含量[5]，但丹参素、原儿茶醛为丹酚酸的水解产物，并且中药制剂发挥功效的物质基础是多种成分协同起效，脑血栓片处方中红花、桃仁、赤芍、丹参、当归、川芎均具有活血、祛瘀的功效，与脑血栓片的功效一致，故本实验采用HPLC法对上述6种有效成分进行了测定，可以更好的控制药品质量。
本实验建立的方法简单、快速、准确，为脑血栓片质量控制提供新方法，提高了药品的质量标准，可用于药品的质量控制。
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