三才封髓丸收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第9册，由熟地黄、黄柏（酒炒）、党参、砂仁、肉苁蓉（酒浸）、天冬、甘草（炙）7味中药组成，具有益肾固精的功效，用于肾气虚弱、梦遗失精等症的治疗。三才封髓丸现行的质量标准相对简单，仅对性状、检查项作了规定，鉴别项仅对部分药材做了定性的研究^[1]。本研究采用高效液相色谱梯度洗脱法同时对三才封髓丸中地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱进行测定，结果表明该方法灵敏度高、重复性好，可用于三才封髓丸的质量控制。

安捷伦1200型高效液相色谱仪，G1315B可变波长检测器；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），AB135-S型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

三才封髓丸购于杭州胡庆余堂药业有限公司，每50丸质量为3 g，批号分别为1415503、1415507、 1415508；地黄苷A（批号81720-05-0，质量分数为98.0%）、地黄苷D（批号81720-08-3，质量分数为98.0%）、木兰花碱（批号2141-09-5，质量分数98.0%）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，黄柏碱对照品（批号6873-13-18，质量分数为97.0%）购于上海纯优生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸、甲醇均为分析纯。

Phenomenex RP C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱条件^{[2, 3, 4, 5, 6]}见表 1；0～28 min地黄苷A和地黄苷D检测波长为203 nm^{[7, 8, 9]}，28～60 min黄柏碱和木兰花碱的检测波长为225 nm^[10]；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量20 μL。理论塔板数均不低于3 500，此系统条件下各组分分离效果良好。

表 1 (Table 1)

表 1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program of mobile phase t /min A/% B/% 0～14 35.0 65.0 14～28 35.0→40.0 65.0→60.0 28～51 40.0→75.0 60.0→25.0 51～60 75.0→35.0 25.0→65.0

表 1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program of mobile phase

分别精密称取地黄苷A对照品9.04 mg、地黄苷D对照品8.20 mg、黄柏碱对照品10.70 mg和木兰花碱对照品10.56 mg，分别置20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱质量浓度分别为0.452、0.410、0.535、0.528 mg/mL的对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液2.5、1.5、4.0、2.5 mL，置50 mL量瓶中，用50%甲醇稀释并加至刻度，制成地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱质量浓度分别为22.6、12.3、42.8、26.4 μg/mL的混合对照品溶液。

取三才封髓丸适量，研成细粉，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理60 min，取出放冷，称定质量，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

按照三才封髓丸质量标准中规定的药味比例，以相同工艺分别制备缺熟地黄和黄柏的阴性样品。按照供试品溶液的制备项下方法操作，即得缺熟地黄、黄柏的阴性样品溶液。

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺熟地黄和黄柏的阴性样品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图 1。结果表明，在对照品色谱峰保留时间相应位置上，供试品溶液有相同保留时间色谱峰，阴性样品溶液在此位置则无，表明阴性样品对所测成分无干扰。

图 1

Fig. 1

1-地黄苷A 2-地黄苷D 3-黄柏碱 4-木兰花碱 1-rehmannioside A 2-rehmannioside D 3-phellodendrine 4-magnoflorine 图 1 混合对照品（A）、三才封髓丸样品（B）、缺熟地黄阴性样品（C）和缺黄柏的阴性样品（D）的HPLC图谱 Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A),Sancai Fengsui Pills (B),sample without Rehmanniae Radix Preparata (C),and sample without Phellodendri Cortex (D)

分别精密吸取对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，分别用50%甲醇溶液稀释成系列对照品溶液。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立线性方程，结果见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 回归方程、相关系数和线性范围 Table 2 Regression equation,correlation coefficients and linear ranges 成 分 回归方程 r 线性范围/(μg·mL−1) 地黄苷A Y＝7.942 5×105 X＋516.7 0.999 3 4.52～90.40 地黄苷D Y＝3.891 7×105 X－219.6 0.999 8 4.10～82.00 黄柏碱 Y＝1.204 2×106 X－157.8 0.999 4 5.35～107.00 木兰花碱 Y＝1.015 1×106 X＋293.4 0.999 6 5.28～105.60

表 2 回归方程、相关系数和线性范围 Table 2 Regression equation,correlation coefficients and linear ranges

精密吸取混合对照品溶液20 μL，按上述色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积，计算得地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱、木兰花碱峰面积的RSD值分别为0.73%、0.89%、1.02%、0.98%。

取批号1415503的三才封髓丸样品6份，制备供试品溶液，依法测定，计算地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱的质量分数，结果其RSD值分别为0.85%、0.73%、1.15%、1.02%。

取批号1415503三才封髓丸样品，制备供试品溶液，分别于0、2、6、8、12、24 h进样，依法测定峰面积，结果地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱峰面积的RSD值分别为0.95%、0.77%、1.18%、0.69%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

取批号1415503的三才封髓丸（含地黄苷A 0.561 mg/g、地黄苷D 0.329 mg/g、黄柏碱1.026 mg/g、木兰花碱0.637 mg/g）6份，适量，研成细粉，取约1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液25 mL，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱的平均回收率分别为98.86%、96.95%、99.15%、96.98%，RSD值分别为1.38%、1.24%、1.28%、0.85%。

取3批三才封髓丸样品，制备供试品溶液，依法进样测定，采用外标法计算三才封髓丸样品中地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱的质量分数，结果见表 3。

表 3 (Table 3)

表 3 三才封髓丸中地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱的测定结果（n=3） Table 3 Determination of rehmannioside A,rehmannioside D,phellodendrine,and magnoflorine in Sancai Fengsui Pills (n=3) 批 号 质量分数/(mg·g−1) 地黄苷A 地黄苷D 黄柏碱 木兰花碱 1415503 0.561 0.329 1.026 0.637 1415507 0.579 0.338 1.032 0.647 1415508 0.512 0.304 0.992 0.613

表 3 三才封髓丸中地黄苷A、地黄苷D、黄柏碱和木兰花碱的测定结果（n=3） Table 3 Determination of rehmannioside A,rehmannioside D,phellodendrine,and magnoflorine in Sancai Fengsui Pills (n=3)

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，对比基线和分离效果，结果显示乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱分离效果好。

分别采用甲醇、50%甲醇、70%甲醇作为提取溶剂，进行考察比较，结果显示50%甲醇提取效果最佳，故选用50%甲醇作为提取溶剂

对不同超声提取时间（30、60、90 min）进行比较，结果表明超声处理60 min和90 min各组分峰面积差异不大，超声处理60 min可基本提取完全，超声处理30 min时地黄苷A和地黄苷D峰面积明显小于超声处理60、90 min的峰面积，黄柏碱和木兰花碱峰面积差异不大。故选取超声处理60 min作为供试品的制备的最佳提取方法。

本实验建立的方法能有效地测定三才封髓丸中4种主要成分，样品中各组分分离度良好，方法简便、重现性好，能够更有效地控制产品质量，可为提高和完善该制剂的质量标准提供参考依据。