止咳平喘颗粒为医院临床经验方，由麻黄、地龙、前胡、连翘等中药组成，具有宣肺平喘、止咳通络的功效，在治疗小儿过敏性咳嗽方面疗效较好。根据该方的临床适应症及临床需求，以及各药味主要成分的理化性质及药理作用，表明该方的主要有效成分均具有醇溶性^{[1, 2]}。本研究以麻黄碱、连翘酯苷A提取率为指标，采用正交试验优选了止咳平喘颗粒处方的最佳提取工艺参数。

1 仪器与材料

安捷伦1100系列高效液相色谱仪；AB204-N型电子分析天平（Mettler Toledo公司）。

盐酸麻黄碱对照品（质量分数99.7%，批号171241-201007）由中国食品药品检定研究院提供；连翘酯苷A对照品（批号79916-77-1，质量分数＞98%）购自成都普兰特生物科技有限公司；实验用药材均购自安国市同羲中药饮片有限公司，经天津药物研究院张铁军研究员鉴定，符合《中国药典》2010年版一部的规定；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果 2.1 盐酸麻黄碱的HPLC法测定

2.1.1 色谱条件

Dikma Diamonsil C₁₈色谱柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（4∶96）（每100毫升加入三乙胺0.2 mL）；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；体积流量：1.0 mL/min；理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3 000。

2.1.2 对照品溶液的制备

称取盐酸麻黄碱对照品适量，加甲醇溶解制成0.04 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密量取提取液15 mL，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性样品溶液的制备

取缺麻黄的其他药材的提取液，同“供试品溶液的制备”方法制成阴性样品溶液。

2.1.5 专属性试验

精密量取盐酸麻黄碱对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录液相色谱图，见图 1。在此色谱条件下盐酸麻黄碱与其他组分能达到基线分离，且阴性样品在对照品相应位置上无吸收峰出现。

2.1.6 线性关系考察

精密称取10.35 mg盐酸麻黄碱对照品，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值。以峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，按最小二乘法进行线性回归，得回归方程Y＝1 986 X－2.808，r＝1.000 0。结果表明盐酸麻黄碱在0.083 2～1.664 0 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验

精密吸取0.104 8 mg/mL盐酸麻黄碱对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，分别连续测定6次，记录峰面积，结果盐酸麻黄碱峰面积的RSD值为0.29%。

2.1.8 稳定性试验

取供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，结果表明，盐酸麻黄碱峰面积的RSD值为1.68%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验

取处方药材6份，50%甲醇提取，得到提取液，制备供试品溶液，进样测定。结果盐酸麻黄碱的平均质量分数为0.87 mg/g，RSD值为1.53%。

2.1.10 回收率试验

精密称取盐酸麻黄碱对照品10.40 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0.416 mg/mL对照品储备液。精密称取处方药材适量，平行9份，分别加入盐酸麻黄碱对照品储备液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，加50%甲醇提取，得到提取液，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果盐酸麻黄碱平均回收率为113.52%，RSD值为3.26%。

2.1.11 处方中盐酸麻黄碱的测定

取处方量药材适量，制备供试品溶液，进样测定，采用外标法计算得盐酸麻黄碱平均质量分数为1.84 mg/g。

2.2 连翘酯苷A的的HPLC法测定 2.2.1 色谱条件

Dikma Diamonsil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸水溶液（34∶66）；检测波长：330 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；体积流量：1.0 mL/min。理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5 000。

2.2.2 对照品溶液的制备

称取连翘酯苷A对照品适量，加甲醇溶解制成0.04 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密量取醇提取液15 mL，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，密塞，摇匀，再精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，密塞，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备

取缺连翘的其他药材的提取液，同“供试品溶液的制备”方法制成阴性样品溶液。

2.2.5 专属性试验

精密量取连翘酯苷A对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录液相色谱图，见图 2。在此色谱条件下连翘酯苷A与其他组分能达到基线分离，且阴性样品在对照品相应位置上无吸收峰出现。

2.2.6 线性关系考察

精密称取12.28 mg连翘酯苷A对照品，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取连翘酯苷A对照品溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值。以峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，按最小二乘法进行线性回归，得回归方程Y＝1 771 X－12.73，r＝0.999 5。结果表明连翘酯苷A在0.098 6～2.464 0 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验

精密吸取0.416 0 mg/mL连翘酯苷A对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，分别连续测定6次，记录峰面积，结果连翘酯苷A峰面积的RSD值为0.25%。

2.2.8 稳定性试验

取供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，结果表明，连翘酯苷A峰面积的RSD值为0.76%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验

取处方药材6份，提取得到提取液，制备供试品溶液，进样测定。结果连翘酯苷A的平均质量分数为0.49 mg/g，RSD值为1.71%。

2.2.10 回收率试验

精密称取连翘酯苷A对照品12.32 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0.492 8 mg/mL对照品储备液。精密称取处方药材适量，平行9份，分别加入连翘酯苷A对照品储备液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，加入50%甲醇提取，得到提取液，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果连翘酯苷A平均回收率为109.02%，RSD值为1.28%。

2.2.11 处方中连翘酯苷A的测定

取处方量药材适量，制备供试品溶液，进样测定，采用外标法计算得连翘酯苷A平均质量分数为0.85 mg/g。

2.3 干膏得率的测定

精密量取水提取液10 mL，至已恒定质量的蒸发皿中水浴蒸干，按《中国药典》2010版一部附录IXG干燥失重法测定，计算干膏得率。

2.4 因素水平的选择

经预试验选择加热回流提取方法，选取乙醇体积分数（A）、乙醇倍量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，因素水平设计见表 1。

2.5 试验方法

称取麻黄、地龙等处方量药材各9份，每份120 g，按L₉(3⁴)正交试验表安排试验，合并提取液，计算干膏得率、麻黄碱、连翘酯苷A提取率。正交试验设计和结果见表 2。

由极差分析可知，以麻黄碱提取率为指标，各因素影响程度顺序为：D＞B＞A＞C，以连翘酯苷A提取率为指标，各因素影响程度顺序为：D＞B＞A＞C。通过直观分析，结合干膏得率及工艺生产成本等因素的考虑，确定最佳工艺条件是A₂B₃C₂D₃，即以各个饮片投料，加65%乙醇8倍量，回流提取3次，每次1 h。

2.6 验证试验

为了进一步确定最佳工艺的合理可行，在确定的最佳提取工艺条件下，提取制备3份样品，依法测定，见表 3。结果麻黄碱平均提取率为87.7%，连翘酯苷A平均提取率为69.8%，干膏平均得率为22.7%，与正交试验表中的最优结果相似，说明确定的提取工艺合理可行。

3 讨论

由于中药复方药味多，化学成分复杂，各药材中有效成分间化学性质有众多相似之处，对于指标成分测定的色谱条件选择上需要经过大量条件摸索，最终确定最佳方法。经查阅文献和预试验^[3]，本方中盐酸麻黄碱的流动相考察了甲醇-水系统和乙腈-水系统，并添加0.1%磷酸水溶液、0.05%磷酸水溶液，加入三乙胺、二正丁胺调pH值为2、3、4。结果表明，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（4∶96），并加三乙胺调pH值为3.2左右时，盐酸麻黄碱的分离度最好，且基线较平稳。

本实验经提取工艺参数优化后得到的最佳提取工艺为加65%乙醇，回流提取3次，每次1 h，加乙醇8倍量。为节约成本，结合工厂生产实际，提取次数及加醇量应再次做进一步考察，进而为实际大生产提供切实可行的提取工艺。