头孢地尼为第3代头孢菌素类抗生素，由日本藤泽药品工业公司研发，1991年首次在日本上市，1997年被美国食品药品管理局（FDA）批准临床使用^[1]，其作用机制为阻止细菌细胞壁的合成，通过与青霉素结合蛋白结合，使细胞壁肿胀、溶解，甚至死亡^[2]。头孢地尼对革兰阳性菌和革兰阴性菌有广范围的抗菌谱，特别是对革兰阳性菌中的葡萄菌属、链球菌属等，比以往的口服抗菌药物有更强的抗菌活性黄芩是唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，性寒，味苦，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。含有黄芩的传统中药制剂多达上千种。黄芩苷是黄芩中主要活性成分，属于黄酮类化合物，具有抗病毒、抗炎、免疫调节等作用^{[1, 2, 3, 4]}。《中国药典》2010年版一部中收录了黄芩片、清开灵胶囊、双黄连注射液等多种含有黄芩苷的成药品种。黄芩苷与多种药物存在相互作用^{[5, 6, 7]}。在心脑血管疾病的防治等方面，随着黄芩苷和硝苯地平合用的几率的增加，有必要研究黄芩苷对硝苯地平在体内过程的影响。细胞色素P450（CYP450）酶是体内重要的药物代谢酶，是体内药物相互作用的重要组成部分。其中CYP3A是CYP450家族丰度最大的亚型，参与临床60%以上药物的代谢。硝苯地平经CYP3A代谢为氧化硝苯地平，可作为CYP3A探针底物用于研究药物相互作用以及药物代谢^[8]。本实验考察了黄芩苷对大鼠体内硝苯地平药动学以及肝微粒体中硝苯地平代谢影响，为黄芩苷的合理应用提供参考。

硝苯地平（批号1000338-200502）、尼群地平（批号100585-201003）对照品均购自中国食品药品检定研究院；氧化硝苯地平对照品（质量分数＞95%）购自美国Sigma公司；黄芩苷原料药（质量分数＞91%）由北京中新制药厂提供；硝苯地平原料药（质量分数＞99%）由青岛格瑞药业有限公司提供；羧甲基纤维素钠（规格300～800 Pa·s）购自中国医药上海化学试剂公司；乙腈、甲醇、甲酸、二氯甲烷均为色谱纯。混合雄性Wistar大鼠肝微粒体（蛋白含量20 g/L）、NADPH再生系统购自汇智泰康生物技术（北京）有限公司。

24只健康雄性Wistar大鼠，体质量（220±10）g，清洁级，合格证号SCXK（鲁）20030004，购自山东大学实验动物中心。Wistar大鼠饲养于清洁级动物房，实验鼠用配合饲料，由山东大学实验动物中心提供。大鼠自由进食饮水，人工照明，12 h/12 h明暗交替，温度18～22 ℃，湿度（50±5）%。

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS/MS、1150 Series HPLC、Hip-ALS SL进样器（美国安捷伦科学技术公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；ABOTT高速离心机（美国雅培公司）；PK514BP超声清洗器（德国BANDEL）；梅特勒-托利多AX-155 Delta Range电子天平（瑞士梅特勒公司）；H97-A恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）。

Wistar大鼠适应性饲养一周后，按体质量随机分为硝苯地平组和硝苯地平＋黄芩苷组（0.2、0.6 g/kg）组，每组6只。硝苯地平＋黄芩苷组分别为ig黄芩苷0.2、0.6 g/kg，硝苯地平组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。大鼠给药前12 h禁食不禁水。30 min后，ig硝苯地平10 mg/kg。灌胃给药时，黄芩苷和硝苯地平均采用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成混悬液，给药容积为7.5 mL/kg。于硝苯地平给药前（0 h）和给药后0.25、0.50、0.75、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24 h颈静脉取血0.4 mL，肝素抗凝，4 000 r/min离心5 min，取血浆，−20 ℃保存备测。

取血浆样品200 μL，加入2.0 μg/mL内标溶液20 μL，涡旋混匀，加入2 mL二氯甲烷，涡旋提取2 min。5 000 r/min离心5 min，吸取上清，水浴N₂吹干。残渣用100 μL流动相复溶，即得。

Diamonsil C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-5 mmol/L乙酸铵（52∶48），体积流量1 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL。

ESI离子源，正离子模式，干燥气（N₂）压力2.76 MPa，干燥气体积流量10 L/min，干燥气温度为350 ℃，毛细管电压4 000 V，碎片电压：硝苯地平和去甲硝苯地平为span>110 V，尼群地平（内标）为100 V；选择性离子检测（SIM），定量离子：硝苯地平m/z 369.0、氧化硝苯地平m/z 345.1、尼群地平m/z 383.1。

硝苯地平、氧化硝苯地平和内标尼群地平对照品溶液、空白样本、空白样本外加对照品溶液、样品经预处理后，按上述测定方法测定，色谱图见图 1。结果表明，各色谱峰形良好，且样品中内源性物质不干扰测定，方法专属性较高。

A-硝苯地平0.10 μg·mL−1和内标溶液 B-空白血浆 C-空白血浆加硝苯地平0.05μg·mL−1和内标溶液 D-硝苯地平＋黄芩苷0.2 g·kg−1给药后0.75 h血浆样品 E-氧化硝苯地平0.50 μg·mL−1和内标溶液 F-空白肝微粒体孵育液 G-灭活肝微粒体孵育液加氧化硝苯地平0.20 μg·mL−1和内标溶液 H-硝苯地平＋黄芩苷0.6 g·kg−1给药后0.75 h血浆样品 1-硝苯地平 2-内标尼群地平 3-氧化硝苯地平 A-nifedipine 0.10 μg·mL−1 and internal standard B-blank plasma C-blank plasma spiked with nifedipine 0.05 μg·mL−1 and internal standard D-plasma from rat 0.75 h after ig administered with nifedipine and 0.2 g·kg−1 baicalin E- oxidized nifedipine 0.50μg·mL−1 and internal standard F- blank rat microsomes G- inactivate rat microsomes spiked with oxidized nifedipine 0.20 μg·mL−1 and internal standard H- plasma from rat 0.75 h after ig administered with nifedipine and 0.6 g·kg−1 baicalin 1-nifedipine 2-nimodipine 3-oxidized nifedipine图 1 含硝苯地平和氧化硝苯地平样品的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of samples containing nifedipine and oxidized nifedipine

取空白大鼠血浆，分别加入适量的硝苯地平对照品溶液，配制成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 μg/mL溶液，每一个质量浓度平行5份，经样品处理后进行测定。药物与内标峰面积比值对质量浓度进行线性回归，得硝苯地平方程Y＝2.312 X＋0.130 4（r＞0.99），线性范围为0.05～3.00 μg/mL。取灭活空白大鼠肝微粒体孵育液，分别加入适量的氧化硝苯地平对照品溶液，配制成0.20、0.40、0.80、1.50、3.00、5.00 μg/mL溶液，每一个质量浓度平行5份，经样品处理后进行测定。药物与内标峰面积比值对质量浓度进行线性回归，得氧化硝苯地平方程Y＝1.712 X＋0.091 7（r＞0.99），线性范围0.20～5.00 μg/mL。硝苯地平、氧化硝苯地平的定量下限分别可达0.05、0.20 μg/mL。

0.10、0.50、2.50 μg/mL血浆质控（QC）样本，经处理后，进行测定。每个质量浓度平行测定5个样本，连续测定3 d，根据当日标准曲线计算质量浓度。结果见表 1。0.40、3.00 μg/mL氧化硝苯地平外加灭活肝微粒体孵育液样本经处理后进行测定，质量浓度分别为（0.38±0.03）、（3.12±0.13）μg/mL，RSD分别为7.5%、4.3%，RE分别为5.01%、3.02%。

表 1(Table 1)

表 1 精密度与准确度试验结果（x±s，n = 5） Table 1 Results of precision and accuracy tests(x±s, n = 5) 加入质量浓度/(μg·mL−1) 日内精密度 日间精密度 测得质量浓度/(μg·mL−1) RSD/% RE/% 测得质量浓度/(μg·mL−1) RSD/% RE/% 0.10 0.098±0.009 9.01 −2.25 0.096±0.010 9.20 −4.23 0.50 0.506±0.034 6.81 1.21 0.524±0.026 4.86 4.87 2.50 2.566±0.152 5.09 2.64 2.580±0.078 3.02 3.15

表 1 精密度与准确度试验结果（x±s，n = 5） Table 1 Results of precision and accuracy tests(x±s, n = 5)

0.10、0.50、2.50 μg/mL血浆QC样品，分别经提取后室温放置7 h、冻融2次以及冷冻14 d后，进行样品分析，每个质量浓度平行5个样本，见表 2。结果表明，室温放置、冻融以及长期冷冻的稳定性良好。

表 2(Table 2)

表 2 硝苯地平在不同条件下的稳定性试验（x±s，n = 5） Table 2 Stability of nifedipine at various conditions (x±s, n = 5) 加入质量浓度/(μg·mL−1) 冷冻前 室温放置7 h 冻融2次 冷冻14 d 测得质量浓度/ (μg·mL−1) RSD/% 测得质量浓度/ (μg·mL−1) RSD/% 测得质量浓度/(μg·mL−1) RSD/% 测得质量浓度/(μg·mL−1) RSD/% 0.10 0.093±0.007 7.61 0.106±0.006 5.74 0.104±0.006 5.85 0.095±0.007 7.41 0.50 0.514±0.032 6.00 0.476±0.028 5.88 0.484±0.033 6.77 0.530±0.033 6.14 2.50 2.440±0.098 4.03 2.611±0.101 3.87 2.35±0.124 5.27 2.66±0.138 5.17

表 2 硝苯地平在不同条件下的稳定性试验（x±s，n = 5） Table 2 Stability of nifedipine at various conditions (x±s, n = 5)

取空白大鼠血浆配制成0.10、0.50、2.50 μg/mL QC样本，测得峰面积（A₁）；以对照品溶液配制0.20，1.00，5.00 μg/mL对照品样本，测得峰面积（A₂）；200 μL空白血浆处理后，分别采用0.20、1.00、5.00 μg/mL对照品溶液100 μL复溶，测得峰面积（A₃）。以A₁/A₃表示提取回收率，A₃/A₂表示基质效应，结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 提取回收率与基质效应试验结果 （x±s，n = 5） Table 3 Results of recovery and matrix effect tests (x±s, n = 5) 加入质量浓度/ (μg·mL−1) 提取回收率试验 基质效应试验 数值/% RSD/% 数值/% RSD/% 0.10 78.6±2.33 2.96 102.5±7.09 6.92 0.50 85.5±3.06 3.58 96.6±5.31 7.58 2.50 84.1±4.12 4.90 107.2±5.52 5.15

表 3 提取回收率与基质效应试验结果 （x±s，n = 5） Table 3 Results of recovery and matrix effect tests (x±s, n = 5)

采用药动学分析软件DAS 2.0，以非房室模型处理血浆浓度-时间数据，获得药动学参数。实验结果以配对t检验进行分析，数据以x±s表示。

各组大鼠灌胃给药后，硝苯地平血浓度均值-时间曲线见图 2，主要药动学参数见表 4。结果表明，与对照组比较，硝苯地平、黄芩苷共同给药后，药动学参数发生改变。其中同时ig 0.6、0.2 g/kg黄芩苷后，硝苯地平质量浓度-时间曲线下面积（AUC）均显著增大，表现为硝苯地平的生物利用度升高。黄芩苷0.6 g/kg组硝苯地平的达峰浓度（C_max）显著升高、药物清除率（CLz）和表观分布容积（Vz）显著降低。黄芩苷0.2 g/kg组硝苯地平的上述药动学参数无显著变化。0.6、0.2 g/kg黄芩苷对硝苯地平的生物半衰期无明显的影响。

图 2 大鼠硝苯地平血浓度均-时间曲线Fig.2 Mean plasma concentration - time curves of nifedipine in rats

表 4(Table 4)

表 4 大鼠ig黄芩苷后硝苯地平主要药动学参数 Table 4 Major pharmacokinetic parameters of nifedipine in rats after ig baicalin 参数 单位 硝苯地平组 硝苯地平＋黄芩苷组 0.2 g/kg 0.6 g/kg AUC0-t μg·mL·h−1 8.15±1.17 9.47±1.91* 10.37±2.92** tmax h 0.95±0.11 0.88±0.13 0.83±0.20* Cmax μg·mL−1 1.05±0.29 1.19±0.25 1.40±0.19** t1/2z h 4.82±1.02 5.13±2.23 5.53±1.76 Clz/F L·kg·h−1 1.20±0.21 1.01±0.10 0.93±0.08* Vz/F L·kg−1 7.23±0.36 7.02±0.84 6.84±0.47* 与硝苯地平组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 *P< 0.05 **P< 0.01 vs control group

表 4 大鼠ig黄芩苷后硝苯地平主要药动学参数 Table 4 Major pharmacokinetic parameters of nifedipine in rats after ig baicalin

硝苯地平经CYP3A代谢为去氧硝苯地平，本实验以大鼠肝微粒体孵育体系中去氧硝苯地平的生成量表示CYP3A的活性。

孵育体系 肝微粒体0.25 mg/mL、MgCl₂溶液浓度5 mmol/L、PBS（pH 7.4）0.1 mol//L、硝苯地平1.5 μg/mL、黄芩苷的质量浓度分别为10、30、90 μg/mL，总反应体积0.5 mL。混匀后，37 ℃水浴中预孵育5 min后，加入1 mmol/L NADPH溶液继续振荡孵育30 min后，立即取出加入冰醋酸乙酯1 mL终止反应。

样品加入内标溶液20 μL，混匀，5 000 r/min低温离心5 min，吸取上层有机相，N₂挥干有机溶剂后，残渣用200 μL流动相复溶，采用LC-MS法测定孵育液中氧化硝苯地平。对照组CYP3A的活性为100%，其他组与之比较。结果见表 5。结果表明黄芩苷可降低大鼠肝微粒体孵育体系中氧化硝苯地平的生成量，因此，黄芩苷可抑制大鼠肝微粒体CYP3A活性，阻碍了硝苯地平氧化代谢途径。

表 5(Table 5)

表 5 黄芩苷对大鼠肝微粒体CYP3A活性影响（x±s，n = 5） Table 5 Inhibitory effect of baicalin on CYP3A activity (x±s, n = 5) 组别 质量浓度/(μg·mL−1) CYP3A活性/% 对照 — 100.0±13.04 黄芩苷 10 81.4±10.14 30 60.1±18.04 90 34.6±18.04** 与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01 *P < 0.05 *P < 0.01 vs model group

表 5 黄芩苷对大鼠肝微粒体CYP3A活性影响（x±s，n = 5） Table 5 Inhibitory effect of baicalin on CYP3A activity (x±s, n = 5)

黄芩苷是黄芩中有效成分之一，具有多种药理活性，在临床上的应用越来越广泛。研究黄芩苷与西药的相互作用有利于含黄芩苷制剂的开发和应用。联合使用的药物大多具有药效的协同作用，同时也可能有相似代谢或转运途径，表现为药动学特征的改变。黄芩苷在防治心脑血管疾病方面具有良好的功效，硝苯地平是防治高血压等循环系统疾病的常用药物，因此本研究探讨了黄芩苷对硝苯地平药动学方面的影响。动物实验的给药剂量是根据临床用药剂量，按照体表面积进行换算所确定的。并且参考了相关文献^{[9, 10, 11]}。

CYP3A酶系是体内重要的药物代谢酶，参与了体内60%药物的代谢，其代谢底物众多，包括环孢素、HMG-CoA还原酶抑制剂、苯二氮类、钙通道阻滞剂、H₁受体拮抗剂等^[12]。硝苯地平主要经肝脏代谢，代谢酶主要为CYP3A酶系^[13]，影响CYP3A酶系的活性或表达的药物均可影响硝苯地平的体内过程。硝苯地平经CYP3A酶系的特异性代谢产物为氧化硝苯地平，因此硝苯地平可以作为CYP3A酶的探针药物，用于研究药物代谢和药物的相互作用^{[8, 14]}。本实验建立的大鼠血浆硝苯地平和肝微粒体孵育体系中氧化硝苯地平的HPLC-MS测定方法灵敏度高，重现性好，适用于大鼠血浆中硝苯地平浓度测定和药动学研究，以及药物相互作用的研究。

大鼠体内研究发现，0.6 g/kg黄芩苷与硝苯地平合用，对硝苯地平的药动学参数有明显的影响，AUC_0-t、C_max明显增加，生物利用度升高。口服药物生物利用度的主要影响因素是肠道细胞CYP3A的生物转化作用和P-gp对药物的主动外排作用。P-gp是一种ATP依赖性膜转运体，组织分布广泛，在药物的吸收、分布、代谢、排泄方面的重要作用，影响药物体内过程的重要因素^{[15, 16, 17]}。药物为CYP3A或P-gp的底物，当其与CYP3A或P-gp的抑制剂同时服用后，药物的口服生物利用度将可能升高。硝苯地平不仅是CYP3A的底物，同时也是P-gp的底物^{[14, 18]}。本研究发现黄芩苷可抑制大鼠肝微粒体CYP3A活性，阻碍了硝苯地平氧化代谢途径。有研究发现，黄芩苷可抑制P-gp的活性，使他莫昔芬、尼莫地平等药物的药动学特征发生改变^{[19, 20, 21]}。黄芩苷体外可增加肝癌细胞的孕烷X受体、组成性雄甾烷受体的活性，上调CYP3A4、MDR1的表达^[22]，但是在体内黄芩苷是否具有此作用和药动学意义，有待于进一步研究。

综上所述，与含有黄芩苷的药物合用，硝苯地平的体内消除延长，生物利用度提高，可能会导致硝苯地平体内蓄积，使药理效应增强，不良反应增加。黄芩苷与CYP3A底物合用时，存在药物相互作用的风险。但由于可能存在的药物代谢酶的种属差异，人体是否具有相似作用，需进一步研究。