阿霉素肾病的形态学改变和动物表现类似人类肾病综合征，是目前公认的理想的肾病综合征模型^[1]。阿霉素代谢产物可直接损伤肾小球上皮细胞，造成足细胞形态学改变，破坏肾小球滤过膜的结构和功能，进而导致蛋白尿的发生。研究表明肾病综合征与体内免疫功能失调和由此所致的炎症损伤有关^[2]，阿奇霉素除具有抗菌作用外，还兼有免疫调节的作用，在阿霉素肾病大鼠中应用能起到减轻肾脏免疫损伤及降低尿蛋白的作用^{[3, 4]}。基因芯片技术依据核酸分子杂交原理检测待测样品的基因序列及表达信息，具有高通量及自动化的特点，其可实现在mRNA水平上同时平行研究数万个基因的表达关系^[5]。本研究通过建立阿霉素肾病大鼠模型，利用Agilent公司生产的Agilent SurePrint G3 Rat Gene Expression（8×60k）基因芯片，检测正常大鼠及阿奇霉素干预前后阿霉素肾病大鼠的肾脏基因表达谱，观察比较经阿奇霉素干预后阿霉素肾病大鼠基因表达谱的改变。

健康雄性Wistar大鼠81只，体质量（180±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001；注射用盐酸阿霉素，规格5 mg/瓶，产品批号130710，海正药业有限公司生产；阿奇霉素片，规格0.5 g/片，产品批号D1420231135，辉瑞制药有限公司生产；金属代谢笼由天津实验动物中心提供。mirVana miRNA Isolation Kit（美国Ambion公司）；QIAGEN RNeasy Mini Kit（德国Qiagent公司）；NanoDrop分光光度计（美国Thermo公司）；PCR 仪（美国ABI公司）；台式多功能冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；2100 Bioanalyzer、杂交炉、扫描仪及GeneSpring分析软件（美国Agilent公司）。基因表达谱芯片为美国Agilent公司生产的Agilent SurePrint G3 Rat Gene Expression（8×60k）芯片。

81只大鼠适应性喂养3 d后开始实验。将全部大鼠采用完全随机数字表法分为对照组、模型组、阿奇霉素组，每组27只，除对照组外，其余两组大鼠均采用2次尾静脉注射注射用盐酸阿霉素制备阿霉素肾病大鼠模型，第1次注射4 mg/kg，1周后第2次注射3.5 mg/kg。对照组同期尾静脉注射同等剂量的生理盐水。试验第4周末检测81只大鼠血生化、24 h尿蛋白，除对照组外其余大鼠均出现24 h尿蛋白＞100 mg/d，提示模型制作成功^{[19, 20]}。第5周起，阿奇霉素组早晨ig 0.025 g/mL阿奇霉素水溶液，1次/d。对照组、模型组灌胃给与同等量的生理盐水1次，各组大鼠均自由饮水及摄食基础饲料。连续灌胃4周。

药物等效剂量换算 以人的标准量阿奇霉素10 mg/（kg·d）等效换算为大鼠用量，换算系数为6.25，阿奇霉素给量＝6.25×10 mg/(kg·d)＝62.5 mg/(kg·d)。前期研究提示该治疗量的阿奇霉素能有效降低阿霉素肾病大鼠尿蛋白水平，减轻炎症反应，发挥免疫调节作用，并具有较好的安全性^[14]。

实验第4、8周末，各组大鼠放置在代谢笼，禁食不禁水，收集24 h尿液，记录总尿量，混匀后留取2 mL用于检测24 h尿蛋白、尿肌酐，计算内生肌酐清除率（Ccr）。

Ccr＝（尿肌酐×24 h尿量）/（血肌酐×1 440×体质量g）

实验第4、8周末，采用内眦取血法对所有大鼠取血2 mL，2 000 r/min离心10 min，收集血清，用于检测血生化指标：总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、总胆固醇（Tcho）、血肌酐（Scr）。

实验第8周末，各组大鼠随机抽取9只，取其一侧肾脏，用准备好的冻存管分装组织，迅速投入液氮冻存。

利用Ambion公司生产的mirVana miRNA Isolation Kit试剂盒提取总RNA。利用QIAGEN RNeasy Mini Kit（美国Qiagen公司）纯化样本总RNA后，取2 μL用NanoDrop分光光度计及Agilent 2100 Bioanalyzer进行定性及定量检测，评估总RNA的浓度、纯度、完整性及A₂₆₀/A₂₈₀吸收率。结果所取样本经检测均达到RIN≥7.0，28S/18S＞0.7且A₂₆₀/A₂₈₀吸收率为1.9～2.2，提示总RNA质量好，可以进行芯片实验。

将每组样本总RNA分别随机分为3个小组，将每个小组中3个样本的总RNA进行混合，按照Agilent公司生产的单色RNA Spike In Kit试剂盒合成cDNA。以含PolyT的cDNA单链为模板，采用Agilent公司的LowInput Quick-Amp Labeling Kit试剂盒以Cy3标记的NTP为原料合成生物素标记的cRNA，应用QIAGEN RNeasy Mini Kit纯化合成的cRNA。使用NanoDrop分光光度计检测标记后的cRNA的浓度及纯度。

提取已用Cy3标记的cRNA 1.65 μg加入Blocking Agent 11 μL，Fragmentation Buffer 2.2 μL，加水至55 μL，将上述片段化液在60 ℃温浴进行片段化30 min，冰浴1 min。继续加入GEx Hybridization Buffer 55 μL混匀。加上述溶液110 μL于芯片上，在65 ℃，10 r/min条件下滚动杂交17 h。取出芯片置于芯片配套专用洗液1中洗涤1 min，再将芯片置于芯片配套专用洗液2中洗涤1 min（37 ℃），晾干。

芯片杂交结果采用 Agilent荧光扫描仪进行扫描，Feature Extraction 软件处理原始图像及提取原始数据，最后应用Genespring软件进行标准化和后续处理。按照P＜0.05，基因表达倍数≥2.0和基因表达倍数≤−2.0为阈值筛选差异表达基因。然后对差异基因进行Gene Ontology和pathway分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。

对血和尿的生化指标采用SPSS 22.0软件进行处理。计量资料采用x±s表示，组间数据比较采用单因素方差分析；组内比较采用配对t检验。

实验第4周，模型组、阿奇霉素组24 h尿蛋白＞100 mg/d，提示造模成功，且模型组、阿奇霉素组Tcho、Scr均明显高于对照组（P＜0.05），Alb、TP、Ccr均明显低于对照组（P＜0.01）；实验第8周，阿奇霉素组与模型组比较，24 h尿蛋白、Tcho、Scr均显著降低（P＜0.01），Alb、TP、Ccr均明显升高（P＜0.01）；阿奇霉素组第8周与第4周比较24 h尿蛋白、Tcho、Scr均显著降低（P＜0.01），Alb、TP、Ccr均明显升高（P＜0.01）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠血、尿指标的动态变化 Table 1 Dynamic changes of blood and urine of the rats in each group 组别 观察时间 24h尿蛋白/mg Alb/(g·L−1) TP/(g·L−1) Tcho/(mmol·L−1) Scr/(μmol·L−1) Ccr/(mL·min−1·kg−1) 对照 4周 4.40±0.82 40.32±4.94 64.47±4.72 2.63±0.46 21.77±1.13 2.07±0.19 8周 4.23±0.65 42.54±4.92 65.68±4.05 2.61±0.46 22.41±2.91 2.12±0.41 模型 4周 221.40±74.53* 24.87±3.32* 53.91±4.93* 4.65±2.25* 39.60±6.03* 1.32±0.24* 8周 354.83±70.87 16.77±3.15 46.73±7.09 8.61±3.24 51.18±5.88 0.31±0.14 阿奇霉素 4周 222.17±77.68* 25.83±3.40* 54.33±4.79* 4.41±1.22* 40.80±5.72* 1.25±0.33* 8周 74.78±12.44▲# 34.79±6.73▲# 60.32±4.13▲# 3.54±0.75▲# 31.56±8.47▲# 1.79±0.68▲# 与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：▲P＜0.05；与同组4周比较：#P＜0.05 *P< 0.05 vs control group; ▲P < 0.05 vs model group; #P < 0.05 vs same group four weeks after treatment

表 1 各组大鼠血、尿指标的动态变化 Table 1 Dynamic changes of blood and urine of the rats in each group

芯片杂交后扫描得到的荧光强度图见图 1，可见荧光信号点距分布均匀、规则、亮度适中，表明芯片杂交效果良好。

图 1 芯片信号扫描图Fig.1 Chip signal scan

单荧光芯片的原始数据经过标准化处理，转化log₂为底的对数后形成的散点图见图 2。水平轴表示该点在样品芯片中标准化后的信号值，垂直轴表示该点在对照芯片中标准化以后的信号值。落在图形对角线上的点代表这个探针点在两张芯片中信号值无差异，而落在图形对角线两侧45°线之外的点代表这个探针点在两张芯片中信号值差异＞2倍。

图 2 杂交信号强度散点图Fig.2 Hybrid signal intensity scatter diagram

经分析发现，与对照组比较，模型组共185个基因发生差异性表达。模型组部分差异表达的基因见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 模型组与对照组相比部分差异基因上、下调情况 Table 2 Up and down regulation of differential genes between the model group and the control group 功能分类 芯片探针号 上/下调倍数 基因代码 GeneBank登录号 编码蛋白/功能 免疫 A_44_P1043157 2.83 CXCL9 NM_145672 趋化因子9 A_44_P1039128 2.19 CXCL10 NM_139089 趋化因子10 A_64_P157743 2.21 CCL20 NM_019233 趋化因子20 A_44_P404843 2.05 CXCR3 NM_053415 趋化因子受体3 A_44_P1004840 2.32 TNFSF9 NM_181384 肿瘤坏死因子超家族9 A_64_P351634 2.16 CSF NM_001029901 集落刺激因子1 细胞凋亡 A_43_P11800 −2.06 BAX U49729 Bcl-2相关X蛋白 细胞周期 A_44_P507571 2.47 CCNE1 NM_001100821 细胞周期蛋白E1 蛋白 A_44_P272210 2.69 CCNE2 NM_001108656 细胞周期蛋白E2 A_42_P580844 3.02 CDK1 NM_019296 细胞周期依赖性激酶1 A_44_P534089 2.11 CCNB1 NM_171991 细胞周期蛋白B1 A_44_P461544 2.74 CCNB2 NM_001009470 细胞周期蛋白B2 信号转导 A_44_P404843 2.05 CXCR3 NM_053415 趋化因子受体3 A_64_P006898 2.96 CD19 NM_001013237 CD19抗原 A_43_P15598 3.31 CD79B NM_133533 CD79B抗原 物质转运 A_44_P306551 −2.24 CACNA1A NM_012918 P/Q型电压依赖性钙通道α亚单位 A_64_P062643 −8.78 PKD2L1 NM_001106352 多囊肾疾病因子1 A_64_P136884 2.13 UPK3A NM_001130507 尿路上皮特异性蛋白1 细胞增殖、 A_64_P054243 −8.26 Pax3 NM_053710 配对盒基因3 分化 A_64_P127971 3.38 POU1F1 NM_013008 POU结构域转录因子1 正值代表基因上调，负值代表下调 Positive represented genes up-regulation and negative regulated represented genes down-regulation

表 2 模型组与对照组相比部分差异基因上、下调情况 Table 2 Up and down regulation of differential genes between the model group and the control group

经Gene Ontology分析，上述差异基因主要涉及的生物学过程有细胞分裂、细胞分化、炎症反应及免疫反应等。经pathway分析，上述差异基因涉及的信号通路有p53信号通路、B细胞受体信号通路、AMPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体通路等，见图 3。

图 3 Pathway analysis of differentially expressed genes between model and control groupFig.3 模型组较对照组差异基因的pathway通路分析

与模型组比较，阿奇霉素组共824个基因发生差异性表达。阿奇霉素组部分差异表达的基因见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 阿奇霉素组与模型组相比部分差异基因上/下调情况 Table 3 Up and down regulation of differential genes between azithromycin and modelgroup 功能分类 芯片探针号 上/下调倍数 基因代码 GeneBank登录号 编码蛋白/功能 免疫 A_44_P1039128 −2.00 CXCL10 NM_139089 趋化因子10 A_43_P11985 −2.47 CCL20 NM_019233 趋化因子20 A_64_P053012 2.96 CD163 NM_001107887 血红蛋白清道夫受体 A_64_P062874 4.27 FGF-20 NM_023961 成纤维细胞生长因子 代谢 A_44_P801714 2.00 SCD1 NM_001013951 固醇辅酶A去饱和酶1 A_44_P387780 3.19 CYP8B1 NM_031241 固醇12α羟化酶 A_44_P1016480 2.19 LPL NM_012598 脂蛋白脂肪酶 发育 A_64_P041219 −4.28 PCSK1 NM_017091 前蛋白转化酶枯草溶菌素1 A_43_P15281 −2.93 TP63 NM_019221 肿瘤蛋白P63 A_44_P415349 2.08 GATA6 NM_019185 GATA 结合蛋白 6 信号转导 A_44_P404843 −2.05 CXCR3 NM_053415 趋化因子配体3 A_44_P233932 4.28 NOTCH1 NM_001105721 Notch家族 防御 A_44_P230370 6.12 DEFA5 NM_173329 防御蛋白α5 A_44_P1023480 7.85 NP4 NM_012598 防御素NP-4前体 转录调控 A_64_P229432 5.88 PPAR-γ NM_001145367 过氧化物酶增值物激活受体 A_64_P040190 3.12 TCF7L2 NM_001191052 转录因子7 A_64_P055960 −15.30 ESR2 NM_012754 雌激素受体2 正值代表基因上调，负值代表下调 Positive represented genes up-regulation and negative regulated represented genes down-regulation

表 3 阿奇霉素组与模型组相比部分差异基因上/下调情况 Table 3 Up and down regulation of differential genes between azithromycin and modelgroup

经Gene Ontology分析，上述差异基因主要涉及的生物学过程包括上皮细胞的分化、脂肪酸代谢、损伤修复、吞噬作用的调节等。经pathway分析，差异基因涉及的通路有PPAR-γ信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路等，见图 4。

图 4 阿奇霉素组较模型组差异基因的pathway通路分析Fig.4 Pathway analysis of differentially expressed genes between azithromycin and model group

阿霉素肾病大鼠肾小球滤过膜通透性增加，大量血浆蛋白通过滤过膜滤出，是蛋白尿发生的病理生理基础；血浆蛋白由尿中大量丢失是形成低白蛋白血症的主要原因，而低白蛋白血症会促进肝脏合成脂蛋白增加，其中的大分子脂蛋白难以从肾脏排出，导致了高脂血症^[21]。阿霉素肾病大鼠肾功能受损，血Scr升高、CCr降低。因此，实验第4周，造模成功的模型组、阿奇霉素组Tcho、Scr均明显高于对照组，Alb、TP、Ccr均明显低于对照组。

本研究发现阿霉素肾病的发生涉及众多基因的改变。通过Gene Ontology分析提示，模型组差异表达的基因涉及的生物学过程主要是炎症及免疫反应，包括差异基因CCL20、CXCL9、CXCL10、CXC3R、CSF-1、TNFSF9等均上调表达，提示炎症及免疫反应在阿霉素肾病发病中具有重要作用。研究发现^{[6, 7]}在许多自身免疫性疾病中CXCL9、CXCL10及其共同受体CXC3R的高表达，可导致T细胞活化和自身抗体的出现，进而导致机体免疫损伤和疾病的发生。张力丹^[8]等发现在狼疮性肾炎小鼠浆膜腔CCL20的表达明显升高，证实其可能参与了狼疮鼠浆膜腔病变的发生并与病情活动及肾损害存在一定相关性。CXCL9、CXCL10、CCL20皆属于趋化因子家族，这一类细胞因子与受体结合后在调控免疫细胞定向迁移、免疫应答过程中起重要作用。肿瘤坏死因子超家族（TNFSF），其含有共同结构序列-TNF同源结构域（THD），通过THD结构域，TNF配体与富含半胱氨酸结构域的TNF受体结合发挥生物学作用，在调节免疫和炎症反应及促进细胞凋亡中起重要作用，TNFSF9是TNFSF成员之一，有研究报道^[9]TNFSF9在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中高表达。集落刺激因子因子1（CSF-1）是一种巨噬细胞生长因子，对巨噬细胞的增殖、分化及趋化具有调节作用，研究认为肾小球上皮细胞过表达的CSF-1与其受体CSF-1R的结合激活巨噬细胞是导致狼疮性肾炎发生、进展的主要机制^[10]。以上这些炎性因子基因的过表达，广泛参与免疫及炎症反应过程，可能会导致肾小球滤过膜的损伤，进而导致阿霉素肾病的发病。

本研究对模型组差异表达的基因进行pathway通路分析，显示p53信号通路的P值＜0.000 1，其P值最小，代表基因富集程度最高及与该研究最为密切，查阅该通路包含的9个基因，其中除BAX下调表达外，CDK1、CCNB1、CCNB2、BAX、RRM2、CCNE1、CCNE2、CDKN1A均上调表达。p53信号通路是调控细胞周期及促进细胞凋亡重要的通路，当细胞受到损伤因素作用而导致DNA受损伤时，p53基因启动表达，其表达产物p53蛋白属于转录因子，作用于下游基因，导致细胞周期停滞或凋亡。p53基因通过与p21基因的启动子结合，促进下游调控分子cyclinE、cyclinB的表达，使细胞周期停滞于G1期或G2期；而p53作用于BAX，可直接诱导细胞凋亡^[11]。足细胞（podocyte），即肾小球脏层上皮细胞，连同肾小球基底膜及毛细血管内皮细胞一同构成肾小球滤过膜。足细胞相关蛋白编码基因的突变或缺失、细胞因子的作用及足细胞的凋亡等均可造成其结构异常或者数量的减少，可导致肾小球滤过膜通透性增加，是NS蛋白尿发生的一个重要环节^[12]。推测p53信号通路可能通过促进足细胞凋亡，进而导致足细胞数量减少及肾小球滤过膜通透性的改变，参与阿霉素肾病的发病。

阿奇霉素除具有良好的抗菌活性外，兼有免疫调节等非抗菌作用。Lin等^[13]发现，阿奇霉素通过抑制Th2细胞合成促炎性因子IL-5，从而降低哮喘患儿气道的高反应性。另有研究表明^[14]，阿奇霉素可以降低阿霉素肾病大鼠肾组织促炎性因子黏附分子ICAM-1的表达及减轻肾组织病理改变。本实验中，与模型组比较，阿奇霉素组经阿奇霉素干预后24 h尿蛋白、Tcho、Scr显著降低，Alb、TP、Ccr明显升高，提示阿奇霉素能起到缓解阿霉素肾病大鼠肾脏损伤及减轻尿蛋白的作用。通过Gene Ontology分析，阿奇霉素组差异基因主要涉及的生物学过程包括上皮细胞的分化、脂肪酸代谢、损伤修复、吞噬作用的调节等。分析发现，在模型组中高表达的CXCL1O、CCL20基因在阿奇霉素组呈下调表达，提示阿奇霉素可能通过下调编码炎症介质基因的表达控制炎症反应，同时该组CD163（血红蛋白清道夫受体）表达上调，研究认为CD163特异性表达于巨噬细胞，能特异性识别血红蛋白（Hb）与结合珠蛋白（HP）形成的Hb-HP复合物而介导Hb的清除，通过多种途径发挥抗炎、抗氧化的功能^[15]。FGF-20属于成纤维细胞生长因子（FGF）家族的一员，其与受体FGFR结合可促进上皮细胞和间质的有丝分裂，在组织炎症损伤修复中发挥作用^[16]。CD163及FGF的上调表达提示阿奇霉素可能在阿霉素肾病大鼠免疫损伤的修复过程中发挥一定作用。

对阿奇霉素组差异表达的基因进行pathway通路分析，提示与本研究最密切的为PPAR-γ信号通路。过氧化物酶增殖物激活受体（peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR）是一类由配体激活的核转录因子超家族，PPAR-γ是其一种表型，在调控细胞周期、抑制炎症反应及脂类代谢中具有重要作用^{[17, 18]}。其与配体结合后调节靶基因的转录表达，在炎症反应过程中通过竞争炎症通路如JAK- STAT通路、NF-κB通路、活化T细胞核因子信号通路（NFAT）等，进而抑制前炎症因子如细胞因子、趋化因子及酶类的表达等；而另一方面PPAR-γ信号通路参与调控脂肪生成、胆固醇代谢、脂肪酸运输等多种脂类活动，本研究筛选出与此通路相关的差异基因包括促进脂肪生成的基因SCD1、胆固醇代谢相关的基因CYP8 B1、脂肪酸运输相关的基因LPL，说明PPAR-γ信号通路参与调节阿霉素肾病大鼠脂质代谢，这可能是与阿奇霉素组较模型组大鼠胆固醇水平降低的原因，但其具体机制需要进一步研究。

综上所述，本研究利用基因芯片技术成功获取了对照大鼠、阿霉素肾病大鼠及阿奇霉素干预后大鼠的肾脏基因表达谱，并比较出各组差异表达的基因及信号通路，证实阿霉素肾病的发病涉及众多基因表达变化及阿奇霉素治疗可以改变其肾脏基因表达谱。众多炎性因子参与的炎症和免疫损伤及p53信号通路可能在阿霉素肾病的发病中发挥重要作用，而在阿霉素肾病中应用阿奇霉素可通过降低炎性因子表达及增加抗炎性因子CD163、FGF-20等的表达参与肾脏炎症及免疫损伤的修复，PPAR-γ信号通路可能参与了调控阿霉素肾病大鼠细胞周期、炎症反应及脂质代谢过程。阿奇霉素可以在基因水平上，使阿霉素肾病大鼠肾组织异常的基因表达实现回归，对进一步探索阿奇霉素干预阿霉素肾病的作用机制提供了线索。