穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的干燥根茎，主产辽宁、吉林、黑龙江等地。其味甘、苦，归肝、肾、肺经，具有祛风除湿、舒筋通络、活血止痛、止咳平喘之功效，用于风湿痹病、关节胀痛、疼痛麻木、跌扑损伤、闪腰岔气、咳嗽气喘^[1]。穿山龙在我国有着悠久的药用历史，其药用价值越来越受到重视。现代药理研究表明穿山龙有调节免疫、祛痰平喘、改善心血管功能等多种作用，其中薯蓣皂苷元是合成甾体激素药的主要原料之一^[2]，皂苷类化合物为心脑血管治疗药物地奥心血康的重要组成成分^[3]。目前穿山龙的质量控制通常以薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元为定性、定量评价其质量^{[4, 5]}，然而单一成分往往难以科学的评价、表征中药复杂体系，中药指纹图谱研究对其全面控制具有重要作用^[6]。通过HPLC方法建立穿山龙药材指纹图谱已有文献报道^{[7, 8]}，但皂苷类成分为末端吸收，灵敏度低，分析时间长。超高效液相色谱（UPLC）具有高分离度、高灵敏度、高效的特点已成为中药指纹控制的重要手段^[9]。本实验采用UPLC法建立穿山龙药材的特征指纹图谱分析方法，其谱峰的保留时间全部在10 min内，为高效、科学、快速地评价穿山龙内在质量提供了依据。

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），带有二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD全波长检测器以及Agilent数据处理工作站；Model C5860A超声仪（CBL Photoelectron Technology Co. Ltd.）；AB204-N（瑞士Mettler Toledo天平公司）

13个不同来源的穿山龙样品由天津世纪天龙药业有限公司提供，经天津药物研究院有限公司孙卫副研究员鉴定为穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的干燥根茎，见表 1。乙腈、甲醇均为色谱纯；水为屈臣氏蒸馏水。薯蓣皂苷（批号111707- 200501）、原薯蓣皂苷（批号111937-201201）、伪原薯蓣皂苷（批号111855-201302）对照品均购自中国食品药品检定研究院。

表 1(Table 1)

表 1不同批次穿山龙样品 Table 1 Different batches of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma 编号 批号 产地 S1 12091201 吉林 S2 13091202 辽宁 S3 13091203 河北 S4 13091205 黑龙江 S5 13091206 吉林 S6 13091208 黑龙江 S7 13091210 河北 S8 1009072 吉林 S9 1010115 吉林 S10 1103301 吉林 S11 13112801 河北 S12 13112802 山西 S13 13112803 河北

表 1不同批次穿山龙样品 Table 1 Different batches of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma

Agilent Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱（50 mm×3.0mm，2.7 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，0～8 min，18%～80%A，8～10 min，80%～100%A；体积流量：0.8 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

取薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷对照品适量，精密称定，用甲醇配制成含薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷质量浓度分别为286.4、555.0、517.0 μg/mL的混合对照品溶液，备用。

称取S1~S13号穿山龙样品粉末约1 g，精密称定，置100 mL具塞三角瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min（功率100 W，频率40 Hz），放至室温，加甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

精密度试验取同一份批号12091201样品供试品溶液，连续进样6次，计算得其各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，符合指纹图谱技术要求^[10]。

取同一批批号12091201样品6份，制备供试品溶液，分别进样，计算得其各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，符合指纹图谱技术要求^[10]。

取同一份批号12091201样品供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，计算得其各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，表明样品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱技术要求^[10]。

取13批穿山龙样品，制备供试品溶液，分别进样，记录不同批次穿山龙UPLC指纹图谱。将药材指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（国家药典委员会发布，2004A版），根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间进行谱峰匹配，并生成对照指纹图谱，结果见图 1、2。

图 1 穿山龙药材UPLC指纹图谱叠加图Fig. 1 UPLC overlapped fingerprint of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma

图 2 穿山龙药材UPLC对照指纹图谱Fig. 2 UPLC reference fingerprint of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma

13批穿山龙药材生成的UPLC对照指纹图谱共有指纹峰14个，通过与对照品对照，分别指认5号峰为原薯蓣皂苷，6号峰伪原薯蓣皂苷，9号峰为薯蓣皂苷。以9号峰为参照峰（S），计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱S峰的保留时间和保留峰面积比值，得到的相对保留时间和相对峰面积见表 2、3。

表 2(Table 2)

表 213批穿山龙指纹图谱共有峰的相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks in 13 batches of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma 峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 平均值 RSD/% 1 0.565 0.564 0.565 0.564 0.566 0.565 0.566 0.566 0.566 0.565 0.565 0.566 0.567 0.565 0.152 2 0.576 0.576 0.577 0.576 0.577 0.577 0.578 0.578 0.578 0.577 0.577 0.578 0.579 0.577 0.155 3 0.582 0.582 0.583 0.582 0.584 0.584 0.585 0.585 0.586 0.585 0.585 0.586 0.587 0.584 0.269 4 0.604 0.604 0.606 0.605 0.607 0.607 0.608 0.608 0.608 0.608 0.609 0.610 0.612 0.607 0.381 5 0.654 0.654 0.655 0.653 0.655 0.654 0.655 0.655 0.655 0.654 0.655 0.655 0.657 0.655 0.132 6 0.669 0.669 0.670 0.668 0.670 0.669 0.670 0.670 0.670 0.670 0.669 0.670 0.671 0.670 0.124 7 0.683 0.683 0.684 0.682 0.684 0.683 0.684 0.684 0.684 0.683 0.683 0.684 0.685 0.683 0.124 8 0.745 0.745 0.745 0.743 0.745 0.744 0.745 0.745 0.745 0.743 0.743 0.744 0.746 0.744 0.107 9(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 10 1.050 1.052 1.052 1.049 1.052 1.051 1.052 1.051 1.051 1.050 1.051 1.051 1.054 1.051 0.102 11 1.239 1.243 1.244 1.241 1.245 1.245 1.248 1.248 1.249 1.247 1.249 1.250 1.253 1.246 0.316 12 1.391 1.395 1.396 1.392 1.397 1.396 1.400 1.400 1.401 1.399 1.401 1.402 1.406 1.398 0.296 13 1.422 1.426 1.428 1.424 1.429 1.427 1.432 1.431 1.433 1.431 1.433 1.434 1.438 1.430 0.304 14 1.518 1.522 1.524 1.520 1.526 1.524 1.529 1.529 1.530 1.529 1.530 1.532 1.536 1.527 0.332

表 213批穿山龙指纹图谱共有峰的相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks in 13 batches of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma

表 3(Table 3)

表 3 13批穿山龙指纹图谱共有峰的相对峰面积值 Table 3 Relative peak area of common peaks in 13 batches of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma 峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 平均值 RSD/% 1 0.380 0.428 0.529 0.118 0.184 0.210 0.112 0.098 0.096 0.058 0.104 0.078 0.277 0.206 74.049 2 0.040 0.045 0.233 0.014 0.059 0.056 0.038 0.044 0.039 0.024 0.034 0.045 0.125 0.061 94.228 3 0.032 0.075 0.083 0.034 0.027 0.020 0.026 0.014 0.018 0.025 0.018 0.015 0.024 0.031 69.830 4 0.012 0.021 0.013 0.007 0.026 0.018 0.029 0.007 0.008 0.005 0.010 0.008 0.032 0.015 59.381 5 0.514 1.080 0.884 0.393 0.642 0.231 0.461 0.267 0.268 0.118 0.359 0.213 1.273 0.516 69.456 6 0.074 0.134 0.391 0.053 0.243 0.045 0.190 0.188 0.184 0.069 0.116 0.118 0.515 0.179 77.373 7 0.039 0.075 0.053 0.019 0.034 0.022 0.025 0.047 0.045 0.015 0.016 0.011 0.056 0.035 54.700 8 0.062 0.136 0.069 0.044 0.076 0.030 0.059 0.032 0.032 0.022 0.059 0.037 0.149 0.062 63.454 9(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 10 0.029 0.033 0.027 0.022 0.030 0.026 0.021 0.019 0.016 0.016 0.022 0.022 0.042 0.025 29.219 11 0.689 0.040 0.032 0.016 0.026 0.019 0.028 0.028 0.026 0.022 0.019 0.021 0.034 0.077 239.023 12 1.400 0.399 0.308 0.161 0.273 0.193 0.228 0.177 0.187 0.154 0.155 0.171 0.375 0.322 104.003 13 0.182 0.082 0.041 0.059 0.050 0.148 0.066 0.083 0.084 0.070 0.068 0.128 0.192 0.096 51.591 14 0.559 0.224 0.136 0.163 0.139 0.620 0.187 0.183 0.223 0.191 0.228 0.350 0.769 0.306 67.915

表 3 13批穿山龙指纹图谱共有峰的相对峰面积值 Table 3 Relative peak area of common peaks in 13 batches of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma

应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（国家药典委员会发布，2004A版）对穿山龙药材指纹图谱进行相似度计算。结果表明，S4、S5、S7～S9、S11、S12相似度良好，大于0.95；S3、S6、S10相似度大于0.9，均符合要求；S1、S2、S13相似度均在0.9以下，分别为0.836、0.893、0.470，这3个药材样品相似度低；说明不同产地药材质量有明显差异，见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 13批穿山龙药材的相似度 Table 4 Similarity of 13 samples of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma 编号 批号 相似度 S1 12091201 0.836 S2 13091202 0.893 S3 13091203 0.909 S4 13091205 0.981 S5 13091206 0.972 S6 13091208 0.941 S7 13091210 0.991 S8 1009072 0.981 S9 1010115 0.984 S10 1103301 0.948 S11 13112801 0.990 S12 13112802 0.976 S13 13112803 0.470

表 4 13批穿山龙药材的相似度 Table 4 Similarity of 13 samples of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma

从13批不同批次穿山龙指纹图谱中获得14个共有特征峰，以这14个共有特征峰的相对峰面积为原始数据，得到13×14阶数据矩阵，运用SPSS 11.5统计分析软件，采用组间联结法，利用欧式距离平方（Squared Euclidean Distance）作为度量，对其进行系统聚类分析，结果见图 3。可见以相似性系数5.0为阈值，可将13批供试品分为4类。第1类为S4～S12；第2类为S2、S3；第3类为S1；第4类为S13。该结果与相似度分析结果一致，除样品S13外，其他样品间具有较好的相似性。

图 3 聚类分析结果Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis

本实验采用相似度分析和聚类分析对不同批次穿山龙的指纹图谱进行评价，两种评价分析方法获得的结果基本吻合，且不同产地和批次的穿山龙相似程度存在一定差异。本实验重点考察了穿山龙药材适生区样品，初步试验结果表明吉林产地药材质量较佳。

实验考察了不同比例的甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液4个流动相系统，结果显示以乙腈-水溶液作为流动相系统时，各峰分离度及峰型良好。因此，最终采用其作为流动相系统。

由于皂苷类成分的最大吸收波长为203 nm末端吸收，因此参考《中国药典》方法中以203 nm为检测波长。实验使用Agilent DAD检测器进行紫外全波长扫描（200～400 nm），分别对203、210、230、265、270、280、300nm等多个波长进行考察，结果显示在203 nm波长下薯蓣皂苷的响应值最高，且色谱峰个数较多，综合比较基线噪音、共有峰响应值、色谱峰个数后，选择203 nm作为本实验的检测波长。

实验将柱温分别控制在25、30、35 ℃进行实验，发现在UPLC条件下随温度的升高，各色谱峰的分离度变差，分析时间缩短。在25 ℃条件下进行UPLC指纹图谱考察各峰分离度和峰型最好。

UPLC采用1.8～2.7 μm的超细色谱柱填料，从而大大提高柱效，本实验结果显示，UPLC法可标示出14个共有峰，且UPLC色谱方法的分离效果更好、灵敏度更高，使穿山龙药材中的物质在10 min内分离成为可能，为快速评价穿山龙药材的质量，建立穿山龙药材的UPLC特征指纹图谱分析方法，完善穿山龙的质量控制方法提供依据。

本实验结果表明应用UPLC建立穿山龙指纹图谱作为质量研究和控制方法，具有高效、快速、灵敏的特点，提高分析效率，同时减少流动相消耗，色谱峰易于匹配，是今后中药及中药复方质量研究和控制的重要手段。