现代药物与临床  2015, Vol. 30 Issue (1): 24-27
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.1674-5515.2015.01.005
雷勇胜, 宋丽明, 郝英魁, 王云, 李瑜, 蒋庆峰. 阿莫西林原料药中有关物质的UPLC-TOF-MS/MS鉴定[J]. 现代药物与临床, 2015, 30(1): 24-27.
LEI Yong-sheng, SONG Li-ming, HAO Ying-kui, WANG Yun, LI Yu, JIANG Qing-feng. Identification of related substances in amoxicillin active pharmaceutical ingredients by UPLC-TOF-MS/MS[J]. DRUGS&CLINIC, 2015, 30(1): 24-27.
阿莫西林原料药中有关物质的UPLC-TOF-MS/MS鉴定
雷勇胜1, 宋丽明1, 郝英魁1, 王云2, 李瑜2, 蒋庆峰1    
1. 天津药物研究院有限公司, 天津 300193;
2. 沃特世科技有限公司, 北京 100026
收稿日期: 2014-10-21;
基金项目： 国家重大新药创制项目(2009ZX09313-026)
作者简介：雷勇胜(1982—),男,助理研究员,研究方向:药物质量研究。Tel:(022)23006878E-mail:leiys@tjipr.com
通讯作者：蒋庆峰(1964—),男,研究员。Tel:(022)23006881E-mail:jiangqf@tjipr.com
摘要：目的 快速鉴定阿莫西林原料药中的有关物质。方法 采用UPLC-TOF-MS/MS法测定。Waters Acquity UPLCTM BEH色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流动相为乙酸铵体系;体积流量0.5 mL/min;检测波长254 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL。电喷雾电离源;正离子检测;毛细管电压3.0 kV;离子源温度120 ℃;雾化气温度500 ℃;雾化气体积流量700 L/h;锥孔气体积流量50 L/h。结果 推测了阿莫西林原料药中6个杂质的化学结构及其裂解规律, 同时与欧洲药典中的杂质进行了比对归属。结论 建立的UPLC-TOF-MS/MS的方法和实验数据可为阿莫西林原料药的质量控制提供了重要依据。
关键词： 阿莫西林     有关物质     UPLC-TOF-MS/MS     裂解规律    
Identification of related substances in amoxicillin active pharmaceutical ingredients by UPLC-TOF-MS/MS
LEI Yong-sheng1, SONG Li-ming1, HAO Ying-kui1, WANG Yun2, LI Yu2, JIANG Qing-feng1    
1. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co. Ltd, Tianjin 300193, China;
2. Waters China Ltd, Beijing 100026, China
Abstract: Objective To establish a rapid identification method for related substances in amoxicillin active pharmaceutical ingredients. Methods UPLC-TOF- MS/MS method was used. HPLC was carried out on Waters Acquity UPLCTM BEH column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) with ammonium acetate solution as mobile phase. The detection wavelength was 254 nm and injection volume was 10 μL at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set for 30 ℃. MS conditions were that a mass spectrometry equipped with electrospray ionization (ESI) (+) source for detection. Capillary voltage was 3.0 kV, and source temperature was 120 ℃. The desolvation temperature and flow rate of desolvation gas were 500 ℃ and 700 L/h. The flow rate of cone gas was 50 L/h. Results The structures and fragmentation regularities of six related substances in amoxicillin were elucidated according to their MS characteristics. At the same time, related substances were compared to the impurities from European Pharmacopoeia. Conclusion UPLC-TOF-MS/MS method and results can establish a basis for quality control and stability study of amoxicillin active pharmaceutical ingredients.
Key words: amoxicillin     related substances     UPLC-TOF-MS/MS     fragmentation regularity    

阿莫西林又名安莫西林、安默西林，是一种常用的青霉素类广谱β内酰胺类抗生素，为一种白色粉末，半衰期约为61.3 min。阿莫西林在高温、光照、酸、碱和氧化条件下会发生降解，生成阿莫西林的相关产物。临床上证实阿莫西林的聚合物会引起过敏反应，所以在生产和贮存过程中产生的有关物质直接影响产品质量和临床用药的安全性。为了控制有关物质、提高产品质量，必须建立有效的分析检测手段。对于阿莫西林中有关物质的研究主要以高效液相色谱法为主[1, 2, 3]，液-质（LC-MS）联用技术为辅[4, 5, 6, 7, 8]。欧洲药典[9]和美国药典[10]都收载了该品种，有关物质检查采用高效液相色谱法，由于流动相中有不挥发性磷酸盐，因此该方法不能直接用于LC-MS联用技术，因此，本实验用乙酸铵替代了磷酸盐，采用改良的色谱条件，通过UPLC- TOF-MS/MS法分析阿莫西林中的有关物质，并根据质谱图推测其结构，为阿莫西林进行质量控制提供了技术保证。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱系统（美国Agilent公司），Waters液相色谱仪（Acquity UPLC体系）和Synapt G2型质谱检测器（美国Waters公司），MassLynx 4.1SCN 712工作站。阿莫西林原料药由石药集团中润制药（内蒙古）有限公司提供，批号120502；甲醇、乙腈（Finnigan公司）均为色谱纯试剂，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 样品处理

取阿莫西林样品约50 mg，精密称定后置于25 mL量瓶中，用流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜滤过，待用。由于样品不稳定，每日实验需新鲜配制。

2.2 HPLC分析

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（2 mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0）-乙腈（99∶1），B相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（2 mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0）-乙腈（80∶20）；梯度洗脱，程序为0～7 min、8%B，7～32 min、8%～100%B，32～47 min、100%B，47～48 min、100%～8%B，48～62 min、8%B；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量50 μL。在254 nm波长处分析测定阿莫西林中的有关物质，结果表明，质量分数＞0.1%的杂质有8个。色谱图见图 1。

图 1 阿莫西林原料药中的有关物质的HPLC图谱Fig. 1 HPLC chromatogram of related substances in amoxicillin active pharmaceutical ingredients
2.3 LC-MS分析

Waters Acquity UPLCTM BEH色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A相为0.005 mol/L乙酸铵缓冲液（乙酸调节pH值至5.0）-乙腈（99∶1），B相为0.005 mol/L乙酸铵缓冲液（乙酸调节pH值至5.0）-乙腈（80∶20）；梯度洗脱，程序为0～3.64 min、0%～60%B，3.64～12.53 min、60%B，12.53～13.09min、60%～0%B，13.09～17 min、0%B；体积流量0.5 mL/min；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

电喷雾电离源；正离子检测；毛细管电压3.0 kV；离子源温度120 ℃；雾化气温度500 ℃；雾化气体积流量700 L/h；锥孔气体积流量50 L/h。

2.4 阿莫西林中有关物质的LC-MS法快速测定

用紫外和正离子同时检测，得PDA（254 nm）色谱图（图 2）和TIC图（图 3）。由于杂质1、8在正负离子两种模式下均没有明显信号出现，实验只对PDA（254 nm）图中的杂质2～7进行了进一步的分析，即TIC图中保留时间分别为0.67、0.94、1.20、2.35、3.24、4.19 min的峰。

图 2 阿莫西林原料药中的有关物质的PDA色谱图Fig. 2 PDA of related substances in amoxicillin active pharmaceutical ingredient

图 3 阿莫西林原料药中的有关物质的TIC色谱图Fig. 3 Total ion mass spectra of related substances in amoxicillin active pharmaceutical ingredients
2.5 有关物质的质谱解析 2.5.1 阿莫西林噻唑酸（杂质D）及其异构体的鉴定

杂质2的一级质谱图中，可得到m/z 367.096 8、384.122 5的主要正离子峰，推断m/z 384.122 5的离子峰为该杂质的M＋1峰，而m/z 367.1为脱去NH3碎片（384.1－17＝367.1），确定分子式为C16H21N3O6S，进一步做二级质谱。在二级质谱图中，出现m/z 367.1、323.1、189.1的碎片离子，其中m/z 323.1为酰胺键断裂产生的碎片，m/z 189.1为第2个酰胺键断裂产生的碎片，结合二级质谱，推导出该化合物为阿莫西林噻唑酸（杂质D），其裂解途径见图 4。杂质3、4的分子离子峰与杂质2的一样，都为m/z 384.1，二级质谱裂解规律也与杂质2一致，推测它们为阿莫西林噻唑酸的异构体，因为阿莫西林噻唑酸有多个手性中心。

图 4 杂质2、3、4的可能的裂解途径Fig. 4 Possible fragmentation pathways of impurity 2, 3, and 4
2.5.2 4-羟基苯甘氨酰阿莫西林（杂质G）的鉴定

杂质5的一级质谱图中，可得到m/z 515.160 3的主要正离子峰，推断m/z 515.160 3的离子峰为该杂质的M＋1峰，确定分子式为C24H26N4O7S，二级质谱图中，出现m/z 498.1、339.1、311.1、160.0、122.1的碎片离子，其中m/z 498.1为脱去NH3的碎片离子，m/z 339.1、60.0为β内酰胺的四元环断裂产生的碎片离子，m/z 311.1为脱去羰基的碎片离子，根据一级、二级质谱的数据，推导出该化合物为4-羟基苯甘氨酰阿莫西林。其裂解途径见图 5。

图 5 杂质5的可能的裂解途径Fig. 5 Possible fragmentation pathways of impurity 5
2.5.3 脱羧阿莫西林噻唑酸（杂质E）的鉴定

杂质6的一级质谱图中，可得到m/z 279.093 5、323.105 7、340.134 4的主要正离子峰，推断m/z 340.134 4的离子峰为该杂质的M＋1峰，而m/z 323.1为脱去NH3的碎片（340.1－17＝323.1），m/z 279.093 5为脱去NH3、CO2的碎片（340.1－17－44＝279.1），确定分子式为C15H21N3O4S，进一步做二级质谱，出现m/z 323.1、189.1、160.0、122.1的碎片离子，其中酰胺键断裂产生m/z 189.1的碎片离子，推导出该化合物为脱羧阿莫西林噻唑酸。其裂解途径见图 6。

图 6 杂质6的可能的裂解途径Fig. 6 Possible fragmentation pathways of impurity 6
2.5.4 阿莫西林噻唑酸和阿莫西林的二聚体（杂质J）的鉴定

杂质7的一级质谱图中，可得到m/z 713.215 9的主要正离子峰，推断m/z 713.215 9的离子峰为该杂质的M＋1峰，确定分子式为C32H39N6O10S2，进一步做二级质谱，二级质谱图中的碎片离子m/z 572.2、160.0是由于β内酰胺的四元环断裂产生的，m/z 555.2为脱去NH3的碎片离子，酰胺键断裂产生m/z 366.1的碎片离子，C-N键断裂产生m/z 349.1的碎片离子，通过质谱分析，推导出该化合物为阿莫西林噻唑酸和阿莫西林的二聚体。其裂解途径见图 7。

图 7 杂质7的可能的裂解途径Fig. 7 Possible fragmentation pathways of impurity 7
2.5.5 阿莫西林原料药中有关物质的归属

杂质2～7都为阿莫西林原料药的降解或聚合产物，具有相似的质谱裂解规律，都很容易脱去NH3、CO、CO2，酰胺键断裂，这些规律对快速鉴定阿莫西林中有关物质的化学结构很有帮助。同时对杂质2～7与欧洲药典中列举的阿莫西林中的杂质进行了比对，根据质谱结果进行了归属，UPLC-MS检测到的杂质的欧洲药典归属、质谱裂解碎片见表 1。

表 1 UPLC-MS检测到的杂质及欧洲药典归属 Table 1 Impurities of detected and corresponding to European Pharmacopoeia
3 讨论

为了促进化合物的离子化，提高质谱检测的灵敏度，尝试在流动相中加入适量的甲酸或乙酸。结果表明，加入甲酸或乙酸后，正离子模式下的质谱响应都明显增强，但加入甲酸后，部分化合物的峰形较差，而在乙酸条件下都能保持较好的峰形。经反复试验，以0.005 mol/L乙酸铵缓冲液（用乙酸调节pH值至5.0）的水溶液作为流动相，可以获得较好的质谱灵敏度和优异的峰形。

本实验建立的对阿莫西林中有关物质的UPLC-MS/MS测定方法，使杂质与主成分获得了良好的分离的同时大大缩短了检测时间，使阿莫西林原料药中的杂质准确、快速地得到鉴定。通过质谱解析，可以快速确定杂质的结构，为阿莫西林的质量控制提供了依据。

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