2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港 222001;
3. 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所, 北京 102206
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. Institute of Virus Disease Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
毒宁注射液体外对禽流感病毒H5N1、人鼻病毒(N36)、腺病毒3(ADV3)均有一定抑制作用[1,2,3]。研究表明热毒宁注射液中3味中药均有一定的抑制病毒作用,如栀子提取物体外对甲型流感病毒、副流感病毒1型(PIV-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇B族病毒3和5型(CoxB3、CoxB5)、单纯疱疹病毒(HSV-1,HSV-2),腺病毒3和5型(AD3、AD5)有明显的抑制作用,其对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用与降低血清中NO水平有关[4]。金银花中主要有效成分绿原酸具有良好的抗人巨细胞病毒(HCMV)的作用,且在不同浓度下可有效地抑制RSV、CoxB3、CoxB5、腺病毒1型和3型的生长[5,6]。金银花对甲3型流感病毒及副流感病毒W型的增殖具有明显的抑制作用[7]。金银花提取物还可有效地抑制甲型流感病毒FM1株、埃可病毒、禽流感病毒AIV(H9N2亚型)的作用。青蒿水提物中分离得到一种缩合鞣质在体外具有抗单纯疱疹病毒(HSV-2)和乙肝病毒(HBV)作用[8]。本实验观察热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒的抑制作用,为临床治疗流感提供依据。 1 材料 1.1 药物与试剂
热毒宁注射液,10 mL/支,批号090505,由江苏康缘药业股份有限公司提供;磷酸奥司他韦胶囊,75 mg/粒,批号090103,由宜昌长江药业股份有限公司生产;DMEM培养基(高糖,含谷氨酰胺)、胎牛血清、牛血清白蛋白组分V、青酶素、链酶素、HEPES缓冲液,TPCK-胰酶(牛胰腺来源VIII型)、Hank’s溶液均由华美公司提供。 1.2 细胞与病毒
狗肾传代细胞(MDCK-P13),由中国国家流感中心提供;甲型H1N1/BJ/09流感病毒,批号09612,由中国国家流感中心提供。 1.3 仪器
CO2培养箱Nuair Usautoflow、倒置可视显微镜(Olympus)由华美公司提供;生物安全三级实验室BSL-3,编号CNAS/BLA/T003,由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。 2 方法与结果 2.1 甲型H1N1流感病毒效价测定
狗肾传代细胞MDCK-P13代,以4×105/mL的浓度接种96孔培养板,37 ℃、5% CO2孵箱培养至MDCK细胞对数生长期最旺盛75%~90%成片细胞,弃掉细胞培养液,采用Hank′s溶液洗细胞2次以去除残留的血清。采用病毒生长液(DMEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL,HEPES 12.5 mL,TPCK-胰酶0.5 mL),2倍稀释7个浓度,每个浓度接种细胞3孔,每孔100 μL,同时设正常细胞作为对照组。37 ℃、5% CO2孵箱,吸附2 h,弃掉病毒稀释液,采用Hank′s溶液洗2次去除未吸附的病毒颗粒,换病毒生长液,每孔100 μL,37 ℃、5% CO2孵箱培养,每天在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化,以25%以下细胞形态CPE变化为“+”,26%~50%细胞形态CPE变化为“++”,51%~75%细胞形态CPE变化为“+++”,76%~100%细胞形态CPE变化为“++++”,用Reed-Muench法,计算病毒半数感染浓度(TCID50)[9]。结果表明,病毒用Reed-Muench法测得甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞TCID50=ln5.25。 2.2 药物对细胞毒性测定 2.2.1 细胞形态变化CPE法
MDCK细胞以4×105/mL的浓度接种96孔培养板,37 ℃、5 % CO2孵箱培养,至细胞单层,弃掉培养液,采用Hank′s溶液洗细胞2次。热毒宁注射液采用DMEM培养基(牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL,HEPES 12.5 mL,TPCK-胰酶0.5 mL)2倍稀释7个浓度,即260.0~4.1 mg/mL。阳性药物对照磷酸奥司他韦采用DMEM培养基,2倍稀释5个浓度,即4 000~250 μg/mL,每个浓度接种细胞3孔,每孔100 μL,同时设MDCK细胞对照,37 ℃、5% CO2孵箱培养3 d,每天在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化,以25%以下细胞形态CPE变化为“+”,26%~50%细胞形态CPE变化为“++”,51%~75%细胞形态CPE变化为“+++”,76%~100%细胞形态CPE变化为“++++”,用Reed-Muench法,计算药物最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)。实验重复3次。结果表明,热毒宁注射液对MDCK细胞的TC0、TC50分别为16.2 mg/mL、(24.5±8.1)mg/mL;磷酸奥司他韦对MDCK细胞的TC0、TC50分别为1.0 mg/mL、(1.8±0.3)mg/mL。结果见表 1。 2.2.2 MTT染色法
观察细胞CPE结果后,加入MTT(四甲基噻唑蓝:采用PBS pH 7.0配制成5 mg/mL的储存液,0.22 μm孔滤膜过滤除菌,4 ℃避光保存)每孔10 μL,置37 ℃培养4 h,然后加入100 μL DMSO,室温20 min,充分溶解细胞(过程中稍加震荡)。然后,采用酶标仪在560 nm波长测定,记录吸光度值,计算药物对细胞的TC0和TC50。实验重复3次。结果表明,热毒宁注射液对MDCK细胞的TC0、TC50分别为16.2 mg/mL、(21.7±9.4)mg/mL;磷酸奥司他韦对MDCK细胞的TC0、TC50分别为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。结果见表 1。
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表 1 镍-热毒宁注射液对MDCK细胞的毒性( Table. 1 Cell toxicity of Reduning Injection on MDCK (`x ± s,n=3) |
MDCK细胞以4×105/mL的浓度接种96孔培养板,培养基为L-谷氨酸完全型DMEM、10%的进口特级胎牛血清。37 ℃,5% CO2孵箱培养至细胞对数生长期最旺盛75%~90%成片细胞,弃掉细胞培养液,采用Hank′s溶液洗细胞2次。将甲型H1N1流感病毒采用病毒生长液(DMEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL,HEPES 12.5 mL,TPCK-胰酶0.5 mL)进行稀释,浓度为100 TCID50,接种经处理的MDCK细胞96孔培养板,每孔100 μL,同时设正常细胞作为对照。37 ℃、5% CO2孵箱中吸附2 h,弃掉病毒稀释液,采用Hank′s溶液洗2次。热毒宁注射液选用对细胞的TC0 2倍稀释9个浓度即16 200.0~63.4 μg/mL 。 同时设阳性药物对照磷酸奥司他韦,药物选用对细胞的TC0 2倍稀释9个浓度,即1 000.0~3.9 μg/mL,每个浓度接种感染细胞3孔,每孔100 μL。实验分1次用药组(不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞1次),3次用药组(不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞,每24小时弃掉旧药液,换同浓度的药液,连续3次)。同时设药物对照(细胞不感染病毒,加入不同浓度的药物)、正常细胞对照、病毒对照(100TCID50病毒液)。37 ℃、5% CO2孵箱培养,每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化,以 25%以下细胞形态CPE变化为“+”,26%~50%细胞形态CPE变化为“++”,51%~75%细胞形态CPE变化为“+++”,76%~100%细胞形态CPE变化为“++++”,至病毒对照出现“++++”时结束试验,用Reed-Muench法计算药物半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)判断药效。试验重复3次。热毒宁注射液作用感染细胞1次组结果表明,IC50为(900.0±173.2)μg/mL,TI为27.2;热毒宁注射液作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(666.7±115.5)μg/mL,TI为36.7。磷酸奥司他韦作用感染细胞1次组结果表明,IC50为(13±2.3)μg/mL,TI为138.5;磷酸奥司他韦作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(10.4±1.1)μg/mL,TI为173.1。结果见表 2。
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表 2 热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒抑制作用(x ± s,n=3) Table. 2 Inhibitionof Reduning Injection in vitro on influenza A/H1N1 influenza virus (`x ± s,n=3) size |
观察细胞病变CPE结果后,加入MTT 5 mg/mL,每孔10 μL,置37 ℃培养4 h,然后加入100 μL DMSO,室温20 min,充分溶解细胞(过程中稍加震荡)。然后,采用酶标仪在570 nm波长测定,记录吸光度值,计算药物IC50和TI,判断药效。试验重复3次。热毒宁注射液作用感染细胞1次组结果表明,IC50为933.3±57.7 μg/mL,TI为23.2;热毒宁注射液作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(866.7±208.1)μg/mL,TI为25.0。磷酸奥司他韦作用感染细胞1次组结果表明,IC50为(14.3±2.3)μg/mL,TI为139.9;磷酸奥司他韦作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(9.8±2.0)μg/mL,TI为204.1。结果见表 2。 3 讨论
中医学称流感为“时行感冒”或“重伤风”。其认识素有“伤寒论”和“温病论”两种,基本病机为卫表不固、肺失宣肃和素体虚弱,治疗的关键是根据患者的病理状态进行整体调治,扶正祛邪,每每配合以化湿、导滞、祛痰、攻结、化瘀等法。热毒宁注射液由青蒿、金银花、栀子组成,具有清热、解毒、疏风之功效,用于治疗外感风热所致感冒、咳嗽,上呼吸道感染所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、疲黄等症。
本实验CPE法结果表明热毒宁注射液最大无毒浓度(TC0)为16.2 mg/mL,半数中毒浓度为(TC50)为(24.5±8.1)mg/mL,CPE法观察热毒宁注射液作用感染细胞1次及3次IC50分别为(900.0±173.2)、(666.7±115.5)μg/mL,根据公式TI=TC50/IC50计算得到热毒宁注射液作用1次及3次TI分别为27.2、36.7;MTT法结果表明热毒宁注射液TC0为16.2 mg/mL,TC50为(21.7±9.4)mg/mL,CPE法观察热毒宁注射液作用感染细胞1次及3次IC50分别为(933.3±57.7)、(866.7±208.1)μg/mL,计算得到热毒宁注射液作用1次及3次治TI分别为23.2、25.0。目前国内外实验室一般使用MTT法和CPE观察法对药物的细胞毒性进行分析[10],以前用CPE法检测药物毒性是最为常用的,在显微镜下逐日观察细胞形态变化,药物浓度高对细胞有毒性时细胞会变圆,固缩坏死甚至脱落。但此法主观性比较强,需要一定的经验,而且耗时。而MTT分析法是使用MTT对细胞进行染,通过检测其吸光度的改变可判断细胞的活性,了解药物对细胞的毒性作用,从而进行药物毒性的定量分析。热毒宁注射液作用1次及3次通过MTT法计算得到的治疗指数比较接近;但CPE法计算得到的治疗指数差异较大,主要是两者半数有效浓度相差较大。结果提示,热毒宁注射液对甲型H1N1流感病毒具有一定的抑制作用,为药物临床用于流感提供试验依据,但其抗流感病毒作用的分子机制还需要进一步研究。
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