毒宁注射液体外对禽流感病毒H5N1、人鼻病毒（N36）、腺病毒3（ADV3）均有一定抑制作用^[1,2,3]。研究表明热毒宁注射液中3味中药均有一定的抑制病毒作用，如栀子提取物体外对甲型流感病毒、副流感病毒1型（PIV-1）、呼吸道合胞病毒（RSV）、柯萨奇B族病毒3和5型（CoxB3、CoxB5）、单纯疱疹病毒（HSV-1，HSV-2），腺病毒3和5型（AD3、AD5）有明显的抑制作用，其对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用与降低血清中NO水平有关^[4]。金银花中主要有效成分绿原酸具有良好的抗人巨细胞病毒（HCMV）的作用，且在不同浓度下可有效地抑制RSV、CoxB3、CoxB5、腺病毒1型和3型的生长^[5,6]。金银花对甲3型流感病毒及副流感病毒W型的增殖具有明显的抑制作用^[7]。金银花提取物还可有效地抑制甲型流感病毒FM1株、埃可病毒、禽流感病毒AIV（H9N2亚型）的作用。青蒿水提物中分离得到一种缩合鞣质在体外具有抗单纯疱疹病毒（HSV-2）和乙肝病毒（HBV）作用^[8]。本实验观察热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒的抑制作用，为临床治疗流感提供依据。 1 材料 1.1 药物与试剂

热毒宁注射液，10 mL/支，批号090505，由江苏康缘药业股份有限公司提供；磷酸奥司他韦胶囊，75 mg/粒，批号090103，由宜昌长江药业股份有限公司生产；DMEM培养基（高糖，含谷氨酰胺）、胎牛血清、牛血清白蛋白组分V、青酶素、链酶素、HEPES缓冲液，TPCK-胰酶（牛胰腺来源VIII型）、Hank’s溶液均由华美公司提供。 1.2 细胞与病毒

狗肾传代细胞（MDCK-P13），由中国国家流感中心提供；甲型H1N1/BJ/09流感病毒，批号09612，由中国国家流感中心提供。 1.3 仪器

CO₂培养箱Nuair Usautoflow、倒置可视显微镜（Olympus）由华美公司提供；生物安全三级实验室BSL-3，编号CNAS/BLA/T003，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。 2 方法与结果 2.1 甲型H1N1流感病毒效价测定

狗肾传代细胞MDCK-P13代，以4×10⁵/mL的浓度接种96孔培养板，37 ℃、5% CO₂孵箱培养至MDCK细胞对数生长期最旺盛75%～90%成片细胞，弃掉细胞培养液，采用Hank′s溶液洗细胞2次以去除残留的血清。采用病毒生长液（DMEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL，HEPES 12.5 mL，TPCK-胰酶0.5 mL），2倍稀释7个浓度，每个浓度接种细胞3孔，每孔100 μL，同时设正常细胞作为对照组。37 ℃、5% CO₂孵箱，吸附2 h，弃掉病毒稀释液，采用Hank′s溶液洗2次去除未吸附的病毒颗粒，换病毒生长液，每孔100 μL，37 ℃、5% CO₂孵箱培养，每天在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，以25%以下细胞形态CPE变化为“＋”，26%～50%细胞形态CPE变化为“＋＋”，51%～75%细胞形态CPE变化为“＋＋＋”，76%～100%细胞形态CPE变化为“＋＋＋＋”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度（TCID₅₀）^[9]。结果表明，病毒用Reed-Muench法测得甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞TCID₅₀＝ln5.25。 2.2 药物对细胞毒性测定 2.2.1 细胞形态变化CPE法

MDCK细胞以4×10⁵/mL的浓度接种96孔培养板，37 ℃、5 % CO₂孵箱培养，至细胞单层，弃掉培养液，采用Hank′s溶液洗细胞2次。热毒宁注射液采用DMEM培养基（牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL，HEPES 12.5 mL，TPCK-胰酶0.5 mL）2倍稀释7个浓度，即260.0～4.1 mg/mL。阳性药物对照磷酸奥司他韦采用DMEM培养基，2倍稀释5个浓度，即4 000～250 μg/mL，每个浓度接种细胞3孔，每孔100 μL，同时设MDCK细胞对照，37 ℃、5% CO₂孵箱培养3 d，每天在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，以25%以下细胞形态CPE变化为“＋”，26%～50%细胞形态CPE变化为“＋＋”，51%～75%细胞形态CPE变化为“＋＋＋”，76%～100%细胞形态CPE变化为“＋＋＋＋”，用Reed-Muench法，计算药物最大无毒浓度（TC₀）和半数中毒浓度（TC₅₀）。实验重复3次。结果表明，热毒宁注射液对MDCK细胞的TC₀、TC₅₀分别为16.2 mg/mL、（24.5±8.1）mg/mL；磷酸奥司他韦对MDCK细胞的TC₀、TC₅₀分别为1.0 mg/mL、（1.8±0.3）mg/mL。结果见表 1。 2.2.2 MTT染色法

观察细胞CPE结果后，加入MTT（四甲基噻唑蓝：采用PBS pH 7.0配制成5 mg/mL的储存液，0.22 μm孔滤膜过滤除菌，4 ℃避光保存）每孔10 μL，置37 ℃培养4 h，然后加入100 μL DMSO，室温20 min，充分溶解细胞（过程中稍加震荡）。然后，采用酶标仪在560 nm波长测定，记录吸光度值，计算药物对细胞的TC₀和TC₅₀。实验重复3次。结果表明，热毒宁注射液对MDCK细胞的TC₀、TC₅₀分别为16.2 mg/mL、（21.7±9.4）mg/mL；磷酸奥司他韦对MDCK细胞的TC₀、TC₅₀分别为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 镍-热毒宁注射液对MDCK细胞的毒性（ Table. 1 Cell toxicity of Reduning Injection on MDCK (`x ± s,n=3) 组 别 细胞形态CPE法 MTT染色法 TC50/(mg·mL−1) TC0/(mg·mL−1) TC50/(mg·mL−1) TC0/(mg·mL−1) 热毒宁注射液 24.5±8.1 16.2 21.7±9.4 16.2 磷酸奥司他韦 1.8±0.3 1.0 2.0 1.0

表 1 镍-热毒宁注射液对MDCK细胞的毒性（ Table. 1 Cell toxicity of Reduning Injection on MDCK (`x ± s,n=3)

MDCK细胞以4×10⁵/mL的浓度接种96孔培养板，培养基为L-谷氨酸完全型DMEM、10%的进口特级胎牛血清。37 ℃，5% CO₂孵箱培养至细胞对数生长期最旺盛75%～90%成片细胞，弃掉细胞培养液，采用Hank′s溶液洗细胞2次。将甲型H1N1流感病毒采用病毒生长液（DMEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL，HEPES 12.5 mL，TPCK-胰酶0.5 mL）进行稀释，浓度为100 TCID₅₀，接种经处理的MDCK细胞96孔培养板，每孔100 μL，同时设正常细胞作为对照。37 ℃、5% CO₂孵箱中吸附2 h，弃掉病毒稀释液，采用Hank′s溶液洗2次。热毒宁注射液选用对细胞的TC₀ 2倍稀释9个浓度即16 200.0～63.4 μg/mL 。 同时设阳性药物对照磷酸奥司他韦，药物选用对细胞的TC₀ 2倍稀释9个浓度，即1 000.0～3.9 μg/mL，每个浓度接种感染细胞3孔，每孔100 μL。实验分1次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞1次），3次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞，每24小时弃掉旧药液，换同浓度的药液，连续3次）。同时设药物对照（细胞不感染病毒，加入不同浓度的药物）、正常细胞对照、病毒对照（100TCID₅₀病毒液）。37 ℃、5% CO₂孵箱培养，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，以 25%以下细胞形态CPE变化为“＋”，26%～50%细胞形态CPE变化为“＋＋”，51%～75%细胞形态CPE变化为“＋＋＋”，76%～100%细胞形态CPE变化为“＋＋＋＋”，至病毒对照出现“＋＋＋＋”时结束试验，用Reed-Muench法计算药物半数有效浓度（IC₅₀）和治疗指数（TI）判断药效。试验重复3次。热毒宁注射液作用感染细胞1次组结果表明，IC₅₀为（900.0±173.2）μg/mL，TI为27.2；热毒宁注射液作用感染细胞3次组结果表明，IC₅₀为（666.7±115.5）μg/mL，TI为36.7。磷酸奥司他韦作用感染细胞1次组结果表明，IC₅₀为（13±2.3）μg/mL，TI为138.5；磷酸奥司他韦作用感染细胞3次组结果表明，IC₅₀为（10.4±1.1）μg/mL，TI为173.1。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒抑制作用（x ± s，n=3） Table. 2 Inhibitionof Reduning Injection in vitro on influenza A/H1N1 influenza virus (`x ± s,n=3) size 组 别 用药次数/次 病毒CPE法 MTT染色法 IC50/(μg·mL−1) TI IC50/(μg·mL−1) TI 热毒宁注射液 1 900.0±173.2 27.2 933.3±57.7 23.2 3 666.7±115.5 36.7 866.7±208.1 25.0 磷酸奥司他韦 1 13.0±2.3 138.5 14.3±2.3 139.9 3 10.4±1.1 173.1 9.8±2.0 204.1

表 2 热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒抑制作用（x ± s，n=3） Table. 2 Inhibitionof Reduning Injection in vitro on influenza A/H1N1 influenza virus (`x ± s,n=3) size

观察细胞病变CPE结果后，加入MTT 5 mg/mL，每孔10 μL，置37 ℃培养4 h，然后加入100 μL DMSO，室温20 min，充分溶解细胞（过程中稍加震荡）。然后，采用酶标仪在570 nm波长测定，记录吸光度值，计算药物IC₅₀和TI，判断药效。试验重复3次。热毒宁注射液作用感染细胞1次组结果表明，IC₅₀为933.3±57.7 μg/mL，TI为23.2；热毒宁注射液作用感染细胞3次组结果表明，IC₅₀为（866.7±208.1）μg/mL，TI为25.0。磷酸奥司他韦作用感染细胞1次组结果表明，IC₅₀为（14.3±2.3）μg/mL，TI为139.9；磷酸奥司他韦作用感染细胞3次组结果表明，IC₅₀为（9.8±2.0）μg/mL，TI为204.1。结果见表 2。 3 讨论

中医学称流感为“时行感冒”或“重伤风”。其认识素有“伤寒论”和“温病论”两种，基本病机为卫表不固、肺失宣肃和素体虚弱，治疗的关键是根据患者的病理状态进行整体调治，扶正祛邪，每每配合以化湿、导滞、祛痰、攻结、化瘀等法。热毒宁注射液由青蒿、金银花、栀子组成，具有清热、解毒、疏风之功效，用于治疗外感风热所致感冒、咳嗽，上呼吸道感染所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、疲黄等症。

本实验CPE法结果表明热毒宁注射液最大无毒浓度（TC₀）为16.2 mg/mL，半数中毒浓度为（TC₅₀）为（24.5±8.1）mg/mL，CPE法观察热毒宁注射液作用感染细胞1次及3次IC₅₀分别为（900.0±173.2）、（666.7±115.5）μg/mL，根据公式TI＝TC₅₀/IC₅₀计算得到热毒宁注射液作用1次及3次TI分别为27.2、36.7；MTT法结果表明热毒宁注射液TC₀为16.2 mg/mL，TC₅₀为（21.7±9.4）mg/mL，CPE法观察热毒宁注射液作用感染细胞1次及3次IC₅₀分别为（933.3±57.7）、（866.7±208.1）μg/mL，计算得到热毒宁注射液作用1次及3次治TI分别为23.2、25.0。目前国内外实验室一般使用MTT法和CPE观察法对药物的细胞毒性进行分析^[10]，以前用CPE法检测药物毒性是最为常用的，在显微镜下逐日观察细胞形态变化，药物浓度高对细胞有毒性时细胞会变圆，固缩坏死甚至脱落。但此法主观性比较强，需要一定的经验，而且耗时。而MTT分析法是使用MTT对细胞进行染，通过检测其吸光度的改变可判断细胞的活性，了解药物对细胞的毒性作用，从而进行药物毒性的定量分析。热毒宁注射液作用1次及3次通过MTT法计算得到的治疗指数比较接近；但CPE法计算得到的治疗指数差异较大，主要是两者半数有效浓度相差较大。结果提示，热毒宁注射液对甲型H1N1流感病毒具有一定的抑制作用，为药物临床用于流感提供试验依据，但其抗流感病毒作用的分子机制还需要进一步研究。