现代药物与临床  2014, Vol. 29 Issue (8): 848-851
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热毒宁注射液体外抑制甲型H1N1流感病毒的研究
孙兰, 段书敏, 周军, 王振中, 毕宇安, 萧伟    
1. 江苏康缘药业股份有限公司, 江苏 连云港 222001;
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港 222001;
3. 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所, 北京 102206
摘要目的 研究热毒宁注射液体外抑制甲型H1N1流感病毒的作用。方法 以奥司他韦为阳性对照,采用CPE和MTT法观察热毒宁注射液对甲型H1N1流感病毒的抑制作用。结果 CPE法结果表明热毒宁注射液最大无毒浓度(TC0)为16.2 mg/mL,半数中毒浓度为(TC50)为(24.5±8.1)mg/mL;MTT法测定结果表明热毒宁注射液TC0为16.2 mg/mL,TC50为(21.7±9.4)mg/mL。热毒宁注射液体外抑制甲型H1N1流感病毒结果显示,CPE法和MTT法热毒宁注射液作用感染细胞1次组半数有效浓度(IC50)为(900.0±173.2)、(933.3±57.7)μg/mL,治疗指数(TI)为27.2、23.2;热毒宁注射液作用感染细胞3次组IC50为(666.7±115.5)、(866.7±208.1)μg/mL,TI为36.7、25.0。结论 热毒宁注射液具有明显体外抗甲型H1N1流感病毒的作用。
关键词热毒宁注射液     流感病毒     甲型H1N1    
In vitro inhibition of Reduning Injection on influenza A/H1N1 influenza virus
SUN Lan1,2, DUAN Shu-min3, ZHOU Jun1,2, WANG Zheng-zhong1,2, BI Yu-an1,2, XIAO Wei1,2    
1. Kanion Pharmaceutical Co., Ltd, Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. Institute of Virus Disease Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To study the inhibitory effects of Reduning Injection on influenza A/H1N1 influenza virus in vitro. Methods With Oseltamivir as positive control, CPE and MTT methods were used to observe inhibitory effects of Reduning Injection on influenza A/H1N1 influenza virus in vitro. Results The CPE method results showed that maximum of no toxicity concentration (TC0) of Reduning Injection was 16.2 mg/mL, and median toxic concentration (TC50) was (24.5 ± 8.1) mg/mL. The MTT method results showed that maximum of no toxicity concentration (TC0) was (16.2 ± 0) mg/mL, and median toxic concentration (TC50) was (21.7 ± 9.4) mg/mL. The in vitro inhibition of influenza A/H1N1 influenza virus of Reduning Injection showed the administration of Reduning Injection to infected cells once, median toxic concentration (TC50) of the CPE method and the MTT method were (900.0 ± 173.2) μg/mL, (933.3 ± 57.7) μg/mL, therapeutic indexes (TI) were 27.2 and 23.2, and administration of Reduning Injection to infected cells for three times, median toxic concentration (TC50) of the CPE method and the MTT method were (666.7 ± 115.5) μg/mL, (866.7 ± 208.1) μg/mL, TI were 36.7 and 25.0. Conclusion Reduning Injection has obvious resistance to the influenza A/H1N1 influenza virus in vitro. Administration of Reduning Injection to infected MDCK cells for three times is superior to the administration of Reduning Injection to infected MDCK cells once.
Key words: Reduning Injection     influenza virus     influenza A/H1N1    

毒宁注射液体外对禽流感病毒H5N1、人鼻病毒(N36)、腺病毒3(ADV3)均有一定抑制作用[1,2,3]。研究表明热毒宁注射液中3味中药均有一定的抑制病毒作用,如栀子提取物体外对甲型流感病毒、副流感病毒1型(PIV-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇B族病毒3和5型(CoxB3、CoxB5)、单纯疱疹病毒(HSV-1,HSV-2),腺病毒3和5型(AD3、AD5)有明显的抑制作用,其对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用与降低血清中NO水平有关[4]。金银花中主要有效成分绿原酸具有良好的抗人巨细胞病毒(HCMV)的作用,且在不同浓度下可有效地抑制RSV、CoxB3、CoxB5、腺病毒1型和3型的生长[5,6]。金银花对甲3型流感病毒及副流感病毒W型的增殖具有明显的抑制作用[7]。金银花提取物还可有效地抑制甲型流感病毒FM1株、埃可病毒、禽流感病毒AIV(H9N2亚型)的作用。青蒿水提物中分离得到一种缩合鞣质在体外具有抗单纯疱疹病毒(HSV-2)和乙肝病毒(HBV)作用[8]。本实验观察热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒的抑制作用,为临床治疗流感提供依据。 1 材料 1.1 药物与试剂

热毒宁注射液,10 mL/支,批号090505,由江苏康缘药业股份有限公司提供;磷酸奥司他韦胶囊,75 mg/粒,批号090103,由宜昌长江药业股份有限公司生产;DMEM培养基(高糖,含谷氨酰胺)、胎牛血清、牛血清白蛋白组分V、青酶素、链酶素、HEPES缓冲液,TPCK-胰酶(牛胰腺来源VIII型)、Hank’s溶液均由华美公司提供。 1.2 细胞与病毒

狗肾传代细胞(MDCK-P13),由中国国家流感中心提供;甲型H1N1/BJ/09流感病毒,批号09612,由中国国家流感中心提供。 1.3 仪器

CO2培养箱Nuair Usautoflow、倒置可视显微镜(Olympus)由华美公司提供;生物安全三级实验室BSL-3,编号CNAS/BLA/T003,由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。 2 方法与结果 2.1 甲型H1N1流感病毒效价测定

狗肾传代细胞MDCK-P13代,以4×105/mL的浓度接种96孔培养板,37 ℃、5% CO2孵箱培养至MDCK细胞对数生长期最旺盛75%~90%成片细胞,弃掉细胞培养液,采用Hank′s溶液洗细胞2次以去除残留的血清。采用病毒生长液(DMEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL,HEPES 12.5 mL,TPCK-胰酶0.5 mL),2倍稀释7个浓度,每个浓度接种细胞3孔,每孔100 μL,同时设正常细胞作为对照组。37 ℃、5% CO2孵箱,吸附2 h,弃掉病毒稀释液,采用Hank′s溶液洗2次去除未吸附的病毒颗粒,换病毒生长液,每孔100 μL,37 ℃、5% CO2孵箱培养,每天在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化,以25%以下细胞形态CPE变化为“+”,26%~50%细胞形态CPE变化为“++”,51%~75%细胞形态CPE变化为“+++”,76%~100%细胞形态CPE变化为“++++”,用Reed-Muench法,计算病毒半数感染浓度(TCID50[9]。结果表明,病毒用Reed-Muench法测得甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞TCID50=ln5.25。 2.2 药物对细胞毒性测定 2.2.1 细胞形态变化CPE法

MDCK细胞以4×105/mL的浓度接种96孔培养板,37 ℃、5 % CO2孵箱培养,至细胞单层,弃掉培养液,采用Hank′s溶液洗细胞2次。热毒宁注射液采用DMEM培养基(牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL,HEPES 12.5 mL,TPCK-胰酶0.5 mL)2倍稀释7个浓度,即260.0~4.1 mg/mL。阳性药物对照磷酸奥司他韦采用DMEM培养基,2倍稀释5个浓度,即4 000~250 μg/mL,每个浓度接种细胞3孔,每孔100 μL,同时设MDCK细胞对照,37 ℃、5% CO2孵箱培养3 d,每天在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化,以25%以下细胞形态CPE变化为“+”,26%~50%细胞形态CPE变化为“++”,51%~75%细胞形态CPE变化为“+++”,76%~100%细胞形态CPE变化为“++++”,用Reed-Muench法,计算药物最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)。实验重复3次。结果表明,热毒宁注射液对MDCK细胞的TC0、TC50分别为16.2 mg/mL、(24.5±8.1)mg/mL;磷酸奥司他韦对MDCK细胞的TC0、TC50分别为1.0 mg/mL、(1.8±0.3)mg/mL。结果见表 12.2.2 MTT染色法

观察细胞CPE结果后,加入MTT(四甲基噻唑蓝:采用PBS pH 7.0配制成5 mg/mL的储存液,0.22 μm孔滤膜过滤除菌,4 ℃避光保存)每孔10 μL,置37 ℃培养4 h,然后加入100 μL DMSO,室温20 min,充分溶解细胞(过程中稍加震荡)。然后,采用酶标仪在560 nm波长测定,记录吸光度值,计算药物对细胞的TC0和TC50。实验重复3次。结果表明,热毒宁注射液对MDCK细胞的TC0、TC50分别为16.2 mg/mL、(21.7±9.4)mg/mL;磷酸奥司他韦对MDCK细胞的TC0、TC50分别为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。结果见表 1

表 1 镍-热毒宁注射液对MDCK细胞的毒性( Table. 1 Cell toxicity of Reduning Injection on MDCK (`x ± s,n=3)
2.3 热毒宁注射液体外抗甲型H1N1流感病毒作用 2.3.1 病毒CPE法

MDCK细胞以4×105/mL的浓度接种96孔培养板,培养基为L-谷氨酸完全型DMEM、10%的进口特级胎牛血清。37 ℃,5% CO2孵箱培养至细胞对数生长期最旺盛75%~90%成片细胞,弃掉细胞培养液,采用Hank′s溶液洗细胞2次。将甲型H1N1流感病毒采用病毒生长液(DMEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 μg/mL,HEPES 12.5 mL,TPCK-胰酶0.5 mL)进行稀释,浓度为100 TCID50,接种经处理的MDCK细胞96孔培养板,每孔100 μL,同时设正常细胞作为对照。37 ℃、5% CO2孵箱中吸附2 h,弃掉病毒稀释液,采用Hank′s溶液洗2次。热毒宁注射液选用对细胞的TC0 2倍稀释9个浓度即16 200.0~63.4 μg/mL 。 同时设阳性药物对照磷酸奥司他韦,药物选用对细胞的TC0 2倍稀释9个浓度,即1 000.0~3.9 μg/mL,每个浓度接种感染细胞3孔,每孔100 μL。实验分1次用药组(不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞1次),3次用药组(不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞,每24小时弃掉旧药液,换同浓度的药液,连续3次)。同时设药物对照(细胞不感染病毒,加入不同浓度的药物)、正常细胞对照、病毒对照(100TCID50病毒液)。37 ℃、5% CO2孵箱培养,每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化,以 25%以下细胞形态CPE变化为“+”,26%~50%细胞形态CPE变化为“++”,51%~75%细胞形态CPE变化为“+++”,76%~100%细胞形态CPE变化为“++++”,至病毒对照出现“++++”时结束试验,用Reed-Muench法计算药物半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)判断药效。试验重复3次。热毒宁注射液作用感染细胞1次组结果表明,IC50为(900.0±173.2)μg/mL,TI为27.2;热毒宁注射液作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(666.7±115.5)μg/mL,TI为36.7。磷酸奥司他韦作用感染细胞1次组结果表明,IC50为(13±2.3)μg/mL,TI为138.5;磷酸奥司他韦作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(10.4±1.1)μg/mL,TI为173.1。结果见表 2

表 2 热毒宁注射液体外对甲型H1N1流感病毒抑制作用(x ± sn=3) Table. 2 Inhibitionof Reduning Injection in vitro on influenza A/H1N1 influenza virus (`x ± s,n=3) size
2.3.2 病毒MTT染色法

观察细胞病变CPE结果后,加入MTT 5 mg/mL,每孔10 μL,置37 ℃培养4 h,然后加入100 μL DMSO,室温20 min,充分溶解细胞(过程中稍加震荡)。然后,采用酶标仪在570 nm波长测定,记录吸光度值,计算药物IC50和TI,判断药效。试验重复3次。热毒宁注射液作用感染细胞1次组结果表明,IC50为933.3±57.7 μg/mL,TI为23.2;热毒宁注射液作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(866.7±208.1)μg/mL,TI为25.0。磷酸奥司他韦作用感染细胞1次组结果表明,IC50为(14.3±2.3)μg/mL,TI为139.9;磷酸奥司他韦作用感染细胞3次组结果表明,IC50为(9.8±2.0)μg/mL,TI为204.1。结果见表 23 讨论

中医学称流感为“时行感冒”或“重伤风”。其认识素有“伤寒论”和“温病论”两种,基本病机为卫表不固、肺失宣肃和素体虚弱,治疗的关键是根据患者的病理状态进行整体调治,扶正祛邪,每每配合以化湿、导滞、祛痰、攻结、化瘀等法。热毒宁注射液由青蒿、金银花、栀子组成,具有清热、解毒、疏风之功效,用于治疗外感风热所致感冒、咳嗽,上呼吸道感染所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、疲黄等症。

本实验CPE法结果表明热毒宁注射液最大无毒浓度(TC0)为16.2 mg/mL,半数中毒浓度为(TC50)为(24.5±8.1)mg/mL,CPE法观察热毒宁注射液作用感染细胞1次及3次IC50分别为(900.0±173.2)、(666.7±115.5)μg/mL,根据公式TI=TC50/IC50计算得到热毒宁注射液作用1次及3次TI分别为27.2、36.7;MTT法结果表明热毒宁注射液TC0为16.2 mg/mL,TC50为(21.7±9.4)mg/mL,CPE法观察热毒宁注射液作用感染细胞1次及3次IC50分别为(933.3±57.7)、(866.7±208.1)μg/mL,计算得到热毒宁注射液作用1次及3次治TI分别为23.2、25.0。目前国内外实验室一般使用MTT法和CPE观察法对药物的细胞毒性进行分析[10],以前用CPE法检测药物毒性是最为常用的,在显微镜下逐日观察细胞形态变化,药物浓度高对细胞有毒性时细胞会变圆,固缩坏死甚至脱落。但此法主观性比较强,需要一定的经验,而且耗时。而MTT分析法是使用MTT对细胞进行染,通过检测其吸光度的改变可判断细胞的活性,了解药物对细胞的毒性作用,从而进行药物毒性的定量分析。热毒宁注射液作用1次及3次通过MTT法计算得到的治疗指数比较接近;但CPE法计算得到的治疗指数差异较大,主要是两者半数有效浓度相差较大。结果提示,热毒宁注射液对甲型H1N1流感病毒具有一定的抑制作用,为药物临床用于流感提供试验依据,但其抗流感病毒作用的分子机制还需要进一步研究。

参考文献
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