X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein gene，XIAP）能够选择性地抑制癌细胞凋亡的上游启动分子Caspase 9和下游效应分子Caspase 3、Caspase 7，使癌细胞抵抗凋亡并对化疗产生耐药。蒽贝素又名信筒子素，是从紫金牛科植物圆齿紫金牛Myrsinaceae ardisia Virens中提取的多酚类化合物，是一种XIAP的小分子抑制剂，能与XIAP蛋白分子中BIR3结构域结合，阻止XIAP分子与Caspase 9结合而诱导细胞凋亡，增加化疗敏感性，减少肿瘤细胞耐药^[1]。研究表明，XIAP表达水平与胰腺癌TNM分期、术后生存期有关^[2]，即XIAP表达水平高的胰腺癌组织恶性程度更高，发生血管浸润及淋巴结转移的机会更高，XIAP蛋白表达水平可作为评价胰腺癌预后的有价值指标。因Mia PaCa-2细胞在人胰腺癌系中具有代表性，且XIAP表达水平稳定，故本研究通过给予不同剂量蒽贝素处理Mia PaCa-2细胞，探讨蒽贝素对人胰腺癌增殖和凋亡的影响并分析其机制，为胰腺癌的治疗寻找毒副作用较小的药物。 1 材料与方法 1.1 药物与试剂

蒽贝素（Sigma公司提供，溶解于DMSO中，冰箱保存），二甲基亚砜（DMSO）和噻唑蓝（MTT）试剂盒购于美国Sigma公司。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（货号40302ES20，规格20 rxn）购于南京凯基生物科技发展有限公司。总RNA的提取Trizol试剂盒（货号15596-026，规格100 mL）为Invitrogen公司产品，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。XIAP、Caspase 3、β-actin单抗购于美国Santa Cruz公司。ECL试剂盒购于美国Amersham Bioscience公司。人胰腺癌细胞Mia PaCa-2由美国得克萨斯州安德森癌症中心惠赠。 1.2 实验方法 1.2.1 MTT检测肿瘤细胞的增殖抑制率

Mia PaCa-2胰腺癌细胞在含10%新鲜小牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养。制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁵/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，过夜，细胞贴壁后对照组加入RPMI 1640培养液，实验组加入蒽贝素（蒽贝素终浓度分别为5、10、20 μmol/L）处理细胞48 h^[3]。每组设4个复孔，每孔加入MTT 20 μL，37 ℃培养4 h。弃上清，加100 μL DMSO。用分光光度计570 nm下测定吸光度值。 1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

取细胞数约1×10⁵个。设4组，每组3个复孔。8 h后待细胞贴壁分别加入等量RPMI 1640、蒽贝素（终浓度分别为5、10、20 μmol/L），继续抚育生长48 h后用胰酶消化离心，500 μL Binding Bufier悬浮细胞；转入EP管内；加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μL，室温避光染色30 min后上机检测。流式细胞仪检测经Single Histogram Statistic软件分析细胞凋亡率。每个浓度样本重复3次，结果以`x ± s表示。凋亡分析以右下象限早期凋亡细胞判定为凋亡细胞。 1.2.3 Western blotting免疫印迹检测

收集处理后的细胞，加入蛋白裂解液，采用ECL试剂盒进行检测。 1.2.4 RT-PCR

细胞总RNA提取按操作说明书执行。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。XIAP引物：上游：5' GAA CTG GCC AGA CTA TGC TCA 3'，下游：5' AAA GTG TCG CCT GTG TTC TGA 3'。β-actin上游：5' GCA CCC AGC ACA ATG AAG ATC 3'，下游：5' CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC 3'。PCR反应体系（20 μL）：cDNA模板2 μL、上下游引物（25 mmol/L）各1 μL、QuantiTect SYBR Green PCR MIX 10 μL、ddH₂O 6 μL，95 ℃、10 min，95 ℃、20 s，57 ℃、20 s，40个循环。计算对照组XIAP表达量相对于实验组的变化^[4]。

CT值指PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数 1.2.5 统计学处理

统计分析由软件包SPSS 15.0完成，计量数据以`x ± s表示，各组间比较采用t检验，每组内不同处理方式比较采用方差分析。 2 结果 2.1 蒽贝素对Mia PaCa-2细胞增殖抑制作用

MTT结果显示，5、10、20 μmol/L蒽贝素对Mia PaCa-2细胞增殖活性均有抑制作用，且随着时间和剂量的增加，细胞存活率明显降低。见表 1。 2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪分析结果显示，与对照组比较，肿瘤细胞凋亡率随药物浓度增加而明显增高，各实验组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示蒽贝素可诱导Mia PaCa-2细胞发生凋亡，并呈明显的剂量相关性，结果见图 1和表 2。 2.3 RT-PCR检测结果

与对照组比较，各实验组经不同剂量蒽贝素作用24～48 h后Mia PaCa-2细胞中XIAPmRNA表达均减低（P＜0.05）。表明经蒽贝素处理后的胰腺癌细胞中的表达量低于对照组，在对照组Mia PaCa-2细胞中XIAPmRNA表达的−△△CT值约为实验组的11.31倍，结果见表 3。

表 1(Table 1)

表 1 蒽贝素对胰腺癌细胞Mia PaCa-2细胞增殖的影响（`x ± s，n=4） Table.1 Effects of embelin on proliferationof pancreatic Mia PaCa-2 cells (`x ± s,n=4) 组 别 剂 量/ (μmol·L−1) 存活率/% 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 对照 — 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 蒽贝素 5 100.00±0.00 97.07±5.31 77.33±1.88 66.90±2.23 64.20±0.60 10 100.00±0.00 91.00±3.31 71.17±1.25 54.03±0.80 54.17±1.21 20 100.00±0.00 90.70±2.22 68.07±1.16 51.33±1.48 52.60±0.82 与对照组比较：P＜0.05 P<0.05 vs control group

表 1 蒽贝素对胰腺癌细胞Mia PaCa-2细胞增殖的影响（`x ± s，n=4） Table.1 Effects of embelin on proliferationof pancreatic Mia PaCa-2 cells (`x ± s,n=4)

图 1 蒽贝素24 h对人胰腺癌Mia PaCa-2细胞凋亡率的影响Fig.1Effects of embelin on apoptosis rates of pancreatic Mia PaCa-2 cells during 24 h

表 2(Table 2)

表 2 不同剂量蒽贝素处理24 h时对Mia PaCa-2细胞生长和凋亡的影响（`x ± s，n=4） Table. 2 Effects of embelin at different doses on growth and apoptosis of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 h(`x ± s,n=4) 组别 剂 量/ (μmol·L−1) 正常细胞率/% 细胞凋亡率/% 对照 — 99.50±10.76 0.50±0.13 蒽贝素 5 93.43±13.87 6.57±0.65 10 86.51±9.97 13.49±1.04** 20 76.11±10.63 23.89±1.51** 与对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01 P<0.05 **P<0.01 vs control group

表 2 不同剂量蒽贝素处理24 h时对Mia PaCa-2细胞生长和凋亡的影响（`x ± s，n=4） Table. 2 Effects of embelin at different doses on growth and apoptosis of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 h(`x ± s,n=4)

Western blot显示Mia PaCa-2细胞的XIAP蛋白表达在20 μmol/L蒽贝素处理24 h后明显下调，在48 h以后尤为显著；此外，蒽贝素对cleaved Caspase 3蛋白有上调作用，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），结果见表 4和图 2。

另外，促凋亡蛋白Bax的表达逐渐增强，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐减弱，与对照组比较差异

表 3(Table 3)

表 3 相同剂量蒽贝素处理细胞24、48 h后对Mia PaCa-2 XIAP mRNA表达的影响（`x ± s，n=3） Table. 3 Effects of embelin insame dose on expression of XIAP mRNA of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 and 48 h (`x ± s,n=3) 组 别 剂 量/ (μmol·L−1) XIAP mRNA表达 24 h 48 h 对照 — 1.00±0.00 1.00±0.00 蒽贝素 10 0.25±0.03 0.12±0.03 20 0.39±0.09 0.07±0.02# 与对照组比较：P＜0.05；24 h时与相同剂量处理组比较：#P＜0.05 P<0.05vs control group; #P<0.05 vs same doses treatment group at 24 h

表 3 相同剂量蒽贝素处理细胞24、48 h后对Mia PaCa-2 XIAP mRNA表达的影响（`x ± s，n=3） Table. 3 Effects of embelin insame dose on expression of XIAP mRNA of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 and 48 h (`x ± s,n=3)

具有统计学意义（P＜0.05），结果见表 5和图 3。各组随着浓度增加和时间推移蒽贝素的作用呈增强趋势。 3 讨论

XIAP在大多数肿瘤细胞株中过表达，其表达与肿瘤的进展、复发、预后以及肿瘤化疗耐药密切相关^[5]。在人类凋亡抑制基因家族8个成员中因BIRC4（XlAP）对caspases凋亡途径的明显抑制作用而成为IAPs（inhibitor of apoptosis proteins）家族

表 4(Table 4)

表 4 蒽贝素处理24 h和48 h对Mia PaCa-2细胞XIAP和Caspase 3裂解片段蛋白表达的影响（`x ± s，n=3） Table. 4 Effects of embelin on protein expression levels of XIAP and cleaved Caspase 3 of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 and 48 h (`x ± s,n=3) 组 别 剂 量/ (μmol·L−1) XIAP蛋白表达 Caspase 3蛋白表达 24 h 48 h 24 h 48 h 对照 — 26.41±1.32 18.63±2.98 蒽贝素 10 25.51±3.09 18.07±1.28 18.49±0.86 20.72±1.64 20 17.29±0.69# 19.89±2.39 12.31±0.54# 23.94±3.12 与对照组比较：P＜0.05；与10 μmol/L蒽贝素比较：#P＜0.05 P<0.05vs control group;#P<0.05 vs 10 μmol/L embelin group

表 4 蒽贝素处理24 h和48 h对Mia PaCa-2细胞XIAP和Caspase 3裂解片段蛋白表达的影响（`x ± s，n=3） Table. 4 Effects of embelin on protein expression levels of XIAP and cleaved Caspase 3 of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 and 48 h (`x ± s,n=3)

图 2 蒽贝素处理24 h和48 h对Mia PaCa-2细胞XIAP和Caspase 3裂解片段蛋白表达的影响 Fig. 2 Effects of embelin on protein expression levels of XIAP and cleaved Caspase 3 of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 and 48 h

表 5(Table 5)

表 5 蒽贝素处理24 h和48 h对Mia PaCa-2细胞Bax/Bcl-2表达的影响（`x ± s，n=4） Table. 5 Effects of embelin on expression levels of apoptotic gene of Bax/Bcl-2 of pancreatic Mia PaCa-2 cells at 24 h and 48 h (`x ± s,n=4) 组 别 剂 量/ (μmol·L−1) Bcl-2表达 Bax表达 24 h 48 h 24 h 48 h 对照 — 34.62±4.86 14.35±2.63 蒽贝素 10 19.04±2.09 20.13±6.59 11.30±2.53 25.93±10.33 20 20.17±1.48 6.04±0.96# 20.76±6.23# 23.41±5.31 与对照组比较：P＜0.05；与10 μmol/L蒽贝素比较：#P＜0.05 P<0.05vs control group;#P<0.05 vs 10 μmol/L embelin group

表 5 蒽贝素处理24 h和48 h对Mia PaCa-2细胞Bax/Bcl-2表达的影响（`x ± s，n=4） Table. 5 Effects of embelin on expression levels of apoptotic gene of Bax/Bcl-2 of pancreatic Mia PaCa-2 cells at 24 h and 48 h (`x ± s,n=4)

中的研究热点和目前抗凋亡治疗中最有潜力的治疗靶点。实验结果表明XIAP mRNA在Mia PaCa-2细胞中表达，这为进一步选择XIAP为胰腺癌治疗靶点奠定了理论基础。

蒽贝素是从植物圆齿紫金牛M. ardisia Virens中提取的具有抗肿瘤、抗炎、抗生育活性的化合物^[6]，可通过与XIAP蛋白BIR3功能域的结合阻止XIAP抑制caspase的活性。研究表明^[7,8]，通过阻止XIAP与Caspase 9结合，蒽贝素在低剂量就可以直接诱导多种肿瘤细胞凋亡，具备化学合成类靶向抗肿瘤药物的基本特征。在本研究中，MTT结果表明，蒽贝素可抑制Mia PaCa-2细胞的增殖并表现为一定的剂量相关性，在一定范围内随着剂量增加，对胰腺癌细胞增殖的抑制作用越来越明显。流式细胞仪分析结果发现，与对照组细胞相比，蒽贝素可明显诱导肿瘤细胞发生凋亡，并且随着药物剂量增加细胞凋亡率也越来越高，证明蒽贝素有促进胰腺癌细胞凋亡作用。Western blotting分析显示，蒽贝素作用Mia PaCa-2细胞24 h后，XIAP蛋白表达明显下降，表明作为XIAP小分子抑制剂的蒽贝素是通过降低XIAP的表达诱导胰腺癌细胞的凋亡。

为研究蒽贝素参与促进Mia PaCa-2细胞凋亡

图 3 蒽贝素处理24 h和48 h对Mia PaCa-2细胞Bax/Bcl-2表达的影响Fig. 3 Effects of embelin on gene expression levels of Bax/Bcl-2 of pancreatic Mia PaCa-2 cells treated for 24 and 48 h

的机制，本实验进一步检测了凋亡下游通路相关蛋白的表达。发现伴随胰腺癌细胞中XIAP的表达降低，导致Mia PaCa-2细胞中Caspase 3活性的显著提高，且表现为随蒽贝素剂量增加和时间延长，Caspase 3裂解片段表达明显增加，与文献报道的XIAP作用机制相符^[9]。Caspase 3是细胞凋亡的执行者，其活化在细胞凋亡信号中起核心作用，激活后可特异性地切割PARP，达到阻止已损伤DNA修复的目的^[10]。本实验的RT-PCR结果也证实经蒽贝素处理后的胰腺癌细胞中XIAP的表达量小于对照组，进一步支持蒽贝素是通过抑制XIAP的表达激活caspases级联凋亡途径诱导的胰腺癌细胞凋亡。

细胞发生凋亡的机制十分复杂，受到严格的基因调控。bcl-2是公认的凋亡调控基因，bax是bcl-2基因家族成员之一，bax和bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。研究表明^[11]，miRNA-21通过直接上调Bcl-2表达，下调Bax的表达阻止胰腺癌Mia PaCa-2细胞凋亡，增强对吉西他滨的耐药性并促进肿瘤细胞增殖。为进一步探究蒽贝素对胰腺癌细胞凋亡的影响是否存在其他途径，本实验同时对Mia PaCa-2细胞Bax/Bcl-2凋亡蛋白进行检测，结果发现蒽贝素可上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，说明蒽贝素可能还通过上调Bax和下调Bcl-2调节细胞线粒体的通透性，从而影响下游促凋亡基因的功能而诱导细胞发生凋亡。

本研究结果显示，在细胞水平上蒽贝素抑制人胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖，明显诱导细胞凋亡，主要通过激活半胱氨酸蛋白酶（caspases）级联反应。由于细胞水平与人体实体肿瘤在细胞生长、分化及迁移有一定差别，尚不能完全模拟肿瘤的真正生长环境与转移特性，故有必要进一步从动物体内研究蒽贝素对胰腺癌的影响，故本研究结果为进一步体内研究蒽贝素的抗肿瘤效果提供实验依据。