TSQ Quantum Ultra三重四极杆串联质谱仪，配备大气压化学电离源，Xcalibur 2.0数据采集软件，LCquan 2.5.6定量处理软件（美国Thermo公司），BT25S天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，LD5—2A离心机（北京医用离心机厂），HY—2型调速多用振荡器（深圳天南海北实业有限公司），CAY—1型液体快速混合器（北京长安仪器厂），TurboVap蒸发仪（美国Zymark公司）。

受试制剂非诺贝特双层渗透泵片，含非诺贝特0.25 g/片，批号20090803，江苏康缘药业股份有限公司提供。参比制剂非诺贝特缓释胶囊，含非诺贝特0.25 g/粒，批号100108，上海爱的发制药有限公司提供。非诺贝特酸对照品（批号130352-200405）、酮洛芬对照品（批号130351-200303）均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇（色谱纯，天津康科德科技有限公司），甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），盐酸（分析纯，沈阳经济技术开发区试剂厂），醋酸乙酯（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），重蒸水（自制）。

健康Beagle犬，体质量8～12 kg，购自沈阳康平实验动物研究所，许可证号为2009-0005。

将6只Beagle犬随机分成2组，每组3只。给药前禁食10 h以上，试验日晨空腹ig受试制剂1片或参比制剂1粒。于给药前（0 h）和给药后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、24、36、48、72 h自犬前肢静脉取血约1.0 mL，并立即移入经肝素处理的离心试管中，3 000～3 500 r/min离心10 min，分离血浆，于−20°C冰箱中保存待测。

取血浆0.1 mL，置10 mL具塞离心试管中，分别加入甲醇-水（50∶50）50 μL、500 ng/mL内标酮洛芬溶液50 μL和0.12 mol/L盐酸溶液50 μL，混匀；加入醋酸乙酯2.0 mL，涡流混合1 min，240次/min往复振荡10 min，3 500 r/min离心5 min，分取上层有机相于另一个试管中，于40 ℃空气流下吹干，残留物加入100 μL流动相溶解，涡流混合，取20 μL进行LC/MS/MS分析。

分析柱为Inertsil ODS-3柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；预柱为迪马公司EasyGuard C₁₈保护柱（8 mm×4.0 mm，5 μm）；流动相为甲醇-1%甲酸（90∶10）；体积流量为0.25 mL/min；柱温为20 ℃；进样量为20 μL。

离子源为大气压化学电离源（APCI源），源喷射电压为4.0 kV，汽化室温度为400 ℃，加热毛细管温度为270 ℃；鞘气（N₂）压力为30 L/min，辅助气（N₂）压力为5 L/min，碰撞气（Ar）压力为23.8 Pa；碰撞诱导解离（CID）电压均为25 eV；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测（SRM）；用于定量分析的离子反应分别为m/z 319→139（非诺贝特酸）和m/z 255→105（酮洛芬）；扫描时间为0.3 s。

精密称取非诺贝特酸对照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/mL非诺贝特酸储备液Ⅰ；取1.0 mL储备液Ⅰ，置于10 mL量瓶中，用甲醇-水（50∶50）稀释并加至刻度，即得100 μg/mL储备液Ⅱ。以甲醇-水（50∶50）稀释储备液Ⅱ，配制非诺贝特酸对照品系列溶液。

精密称取酮洛芬对照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/mL储备液Ⅰ；取5.0 mL储备液Ⅰ，置于10 mL量瓶中，用甲醇-水（50∶50）稀释并加至刻度，即得500 μg/mL的储备液Ⅱ；取0.1 mL储备液Ⅱ，置于100 mL量瓶中，用甲醇-水（50∶50）稀释并加至刻度，即得500 ng/mL内标溶液。

取Beagle犬的空白血浆0.1 mL，除不加内标溶液外，其余按2.2项下血浆样品处理方法操作；取Beagle犬的空白血浆0.1 mL，加入40.0 ng/mL非诺贝特酸对照品溶液50 μL和500 ng/mL内标溶液50 μL，按2.2项下血浆样品处理方法操作；另取Beagle犬ig非诺贝特受试制剂0.25 g后2 h的血浆样品，按2.2项下血浆样品处理方法操作。以上样品均进样20 μL，得色谱图。结果表明：非诺贝特酸和内标酮洛芬的保留时间分别为2.69、2.20 min，空白血浆中的内源性物质不干扰测定。

1-酮洛芬 2非诺贝特酸 1-ketoprofen 2- fenofibric acid图 1 血浆（A），血浆＋对照品＋内标物（B）和血浆样品（C）中非诺贝特酸及内标酮洛芬的SRM色谱图Fig. 1 SRM chromatogram of plasma(A), plasma + fenofibric acid + ketoprofen (internal standard), and sample (C)

取空白血浆0.1 mL，加入非诺贝特酸对照品系列溶液50 μL，配制成相当于非诺贝特酸血浆浓度为10、20、50、200、500、2 000、5 000 ng/mL样品，按2.2项下血浆样品处理方法操作，每一个浓度进行双样本分析，进样20 μL，记录色谱图；以待测物质量浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得回归方程Y=5.727×10⁻³ X－9.582×10⁻³（r²= 0.995 6），结果表明非诺贝特酸在10～5 000 ng/mL线性关系良好。

取空白血浆0.1 mL，按2.7标准曲线的绘制项下的方法配制低、中、高3个质量浓度（非诺贝特酸血浆质量浓度分别为20、500、4 000 ng/mL）的样品，每一个质量浓度各6份，按照2.2血浆样品处理项下方法处理，进样分析，连续测定3 d，计算日内及日间精密度，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 精密度试验结果 Table 1 Results of precisions test 质量浓度/(μg·mL−1) 日内精密度 日间精密度 测定质量浓度/(ng·mL−1) RSD/% 测定质量浓度/(ng·mL−1) RSD/% 20.0 21.2±1.0 4.7 20.8±1.6 7.8 500.0 507.0±43.6 8.6 500.1±42.1 8.4 4 000.0 4 052.7±341.4 8.4 4 059.4±314.0 7.7

表 1 精密度试验结果 Table 1 Results of precisions test

取空白血浆0.1 mL，按2.7标准曲线的绘制项下的方法配制低、中、高3个质量浓度（非诺贝特酸血浆浓度分别为20、500、4 000 ng/mL）的样品，每一个浓度进行6个样本分析。同时另取空白血浆0.1 mL，除不加内标溶液外，按照2.2血浆样品处理项下方法操作，向获得的上清液中加入相应浓度的对照品溶液50 μL和内标溶液50 μL，涡流混合，40 ℃空气流下吹干。残留物以流动相溶解，进样分析，获得相应峰面积（3次测定的平均值）。以每一个浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率，见表 2。结果表明，所建立的测定Beagle犬血浆中非诺贝特酸的分析方法符合《中国药典》要求，可用于非临床药动学试验。

表 2(Table 2)

表 2 提取回收率试验结果 Table 2 Results of extraction recovery 质量浓度/ng·mL−1) 回收率/% RSD/% 20.0 92.5±10.5 10.5 500.0 83.6±6.6 7.9 4 000.0 85.4±7.3 8.6

表 2 提取回收率试验结果 Table 2 Results of extraction recovery

分别考察了血浆样品经液-液萃取处理后室温放置24 h、血浆样品室温放置4 h、血浆样品经历3次冷冻-解冻循环及血浆样品于−20 ℃冷冻放置60 d的稳定性，结果见表 3。可见血浆样品经上述条件处理和放置后比较稳定。

表 3(Table 3)

表 3 血浆样品稳定性试验结果 Table 3 Stability results of fenofibric acid in plasma 放置条件 质量浓度/(ng·mL−1) 测定质量浓度/(ng·mL−1) RSD/% 液-液萃取后室温放置 20.0 20.3±2.3 11.2 4 000.0 3810.6±168.9 4.4 室温放置 20.0 21.2±1.6 7.3 4 000.0 3 813.9±205.8 5.4 冷冻-解冻循环 20.0 21.1±1.6 7.4 4 000.0 3 644.9±124.2 3.4 冷冻放置 20.0 22.3±0.8 3.8 4 000.0 3 830.5±448.7 11.7

表 3 血浆样品稳定性试验结果 Table 3 Stability results of fenofibric acid in plasma

采用DAS 2.1.1数据处理软件，计算Beagle犬ig受试制剂和参比制剂后的药动学参数，结果见表 4。平均血药浓度-时间曲线见图 2。

图 2 分别ig非诺贝特受试制剂和参比制剂后非诺贝特酸的平均药时曲线Fig. 2 Mean plasma concentration-time curve of fenofibric acid after ig administration of test preparation and reference preparation

表 4(Table 4)

表 4 受试制剂和参比制剂中非诺贝特酸药动学参数 Table 4 Pharmacokinetic parameters of fenofibric acid after ig test preparation and reference preparation 参数 单 位 受试制剂 参比制剂 t1/2 h 17.7 16.4 MRT0-t h 24.7 24.5 MRT0-∞ h 30.7 29.1 tmax h 6.7 2.5 Cmax ng·mL−1 1 100.0 924.3 AUC0-t ng·h·mL−1 17 725.0 17 086.9 AUC0-∞ ng·h·mL−1 18 649.8 18 789.4 AUC0-t/AUC0-∞ 0.924 0.932

表 4 受试制剂和参比制剂中非诺贝特酸药动学参数 Table 4 Pharmacokinetic parameters of fenofibric acid after ig test preparation and reference preparation

以统计矩方法统计结果中的AUC_0-t，计算相对生物利用度（F）。结果受试制剂中非诺贝特酸的平均相对生物利用度为（104.7±12.4）%。

F=AUC_0-t（test）/AUC_0-t（reference）

采用DAS 2.1.1软件，对药动学参数进行统计学分析。

受试制剂与参比制剂的AUC_0-t、AUC_0-∞、C_max方差分析结果见表 5。结果显示，上述参数数据在制剂间和周期间的差异无统计意义，在个体间的差距有统计学意义（P＜0.05）。

表 5(Table 5)

表 5 主要药动学参数方差分析结果 Table 5 ANOVA results of main pharmacokinetic parameters 参数 F值 制剂间 周期间 个体间 AUC0-t 0.636 0.598 251.428** AUC0-∞ 0.442 0.118 100.153** Cmax 1.056 0.282 107.910** F0.05(1,4)=21.20 F0.05(5,4)=15.52 **P< 0.01

表 5 主要药动学参数方差分析结果 Table 5 ANOVA results of main pharmacokinetic parameters

AUC_0-t、AUC_0-∞、C_max双向单侧t检验结果及[1-2α]置信区间分析见表 6。结果显示受试制剂中，非诺贝特酸的AUC_0-t的90%置信区间为参比制剂的93.5%～115.9%，AUC_0-∞的90%置信区间为参比制剂的89.3%～124.2%，C_max的90%置信区间为参比制剂的91.2%～129.9%。

表 6(Table 6)

表 6 药动学参数双单侧检验和[1－2α]置信区间检验结果 Table 6 The t-test and confidence interval results of main pharmacokinetic parameters 参数 t1 t2 90%置信区间 AUC0-t 5.222 3.626 93.5～115.9 AUC0-∞ 3.546 2.215 89.3～124.2 Cmax 5.329 3.286 91.2～129.9

表 6 药动学参数双单侧检验和[1－2α]置信区间检验结果 Table 6 The t-test and confidence interval results of main pharmacokinetic parameters

采用LC-MS-MS法测定了Beagle犬血浆中非诺贝特酸，并进行了方法确证。血浆样品经液-液萃取后，采用APCI源，以SRM扫描方式进行定量分析，血浆中的内源性物质不干扰待测物的测定。本方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，适合非诺贝特双层渗透泵片在Beagle犬体内的生物利用度和生物等效性研究。

采用交叉给药的方式进行了受试制剂和参比制剂在Beagle犬体内的药动学研究，经统计学分析后，受试制剂和参比制剂各药动学参数差异无显著性，因此可认为非诺贝特双层渗透泵片与缓释胶囊具有生物等效性。