糖尿病是因自身免疫失调、基因或代谢异常而引起胰岛素缺乏和/或糖异生增加、血糖升高的一类内分泌疾病^[1]。国际糖尿病基金会的研究表明全球1型和2型糖尿病的患病率为8.3%。1型和多数2 型糖尿病患者由于胰岛β细胞损伤或功能失调均需给予胰岛素治疗^[2,3,4]。重组人胰岛素是以重组DNA技术合成的一种多肽类激素，其分子结构中包含51个氨基酸残基，与人胰岛β细胞生成的天然人胰岛素结构相同。为实现特定的药动学和药效学特征，满足不同患者的治疗和应用需求，各种重组胰岛素制剂和重组胰岛素类似物不断涌现。重组人胰岛素注射液Insulin R和Humulin R均通过Eschericha coli菌株生产而得，制剂中未加入其他改变药物吸收速率和作用时间的物质^[5]。通过以美国Lilly公司的Humulin R为对照品，评价国产重组人胰岛素注射液Insulin R供试品在正常Beagle犬体内的相对生物利用度，并对两者进行生物等效性评价。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 受试药物

重组人胰岛素注射液（Insulin R），规格3 mL∶300 U，批号20111202，合肥天麦生物科技发展有限公司提供。重组人胰岛素注射液（优泌林R，Humulin R），规格3 mL∶300 U（笔芯），1支/盒，批号A850900C，分包装批号L02227，法国礼来公司生产。 1.1.2 试剂

抑肽酶，比活＞5 500 U/mg，规格5 mg/瓶，美国罗氏公司产品（进口分装），批号6247884，2～8 ℃保存。 1.1.3 放射免疫分析试剂盒

人胰岛素放射免疫分析试剂盒（Human Insulin Specific RIA Kit）为美国Millipore公司产品，编号HI-14K，该试剂盒主要用于定量测定血清、血浆中人胰岛素的含量。犬C肽放射免疫分析试剂盒（Canine C-Peptide RIA Kit）为美国Millipore公司产品，编号CCP-24HK，该试剂盒主要用于定量测定血清、血浆中犬C肽的含量。 1.1.4 仪器

Thermo Scientific Sorvall ST 16R低温离心机，为美国Thermo公司产品。GAMMA—C12γ计数仪，为美国德普公司产品（附数据处理软件）。Accu-Chek Performa卓越型血糖仪及配套血糖试纸，均为罗氏公司产品。 1.1.5 实验动物

健康成年Beagle犬，12只，雌雄各半，体质量8～10 kg，7～8月龄，由安徽省阜阳市维光实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（皖）2011-001，实验动物质量合格证0000399。实验动物单笼饲养于全封闭观察室，适应期1个月。观察室温度：16～26 ℃，湿度：40%～70%，光照：昼夜明暗交替时间为12 h/12 h，通风：换气次数不低于8次/h，实验动物使用许可证SYXK（津）2011-0005。 1.2 方法 1.2.1 剂量设计

Humulin R的临床剂量（代偿期）为0.1～0.5 U/(kg∙d⁻¹)，餐前0.5 h给药，3次/d。按体表面积折合Beagle犬等效剂量约为0.17～0.86 U/(kg∙d⁻¹)，考虑采用健康Beagle犬作为实验动物，最终选择0.5 U/kg剂量作为Insulin R和Humulin R药动学的给药剂量。 1.2.2 试验分组及给药

12只健康成年Beagle犬在适应期结束后，随机分成2组，每组6条，雌雄各半。第1次试验，第1组动物于犬颈背部sc受试药Insulin R，剂量为0.5 U/kg，给药体积0.1 mL/kg；第2组动物sc同剂量同体积的对照药Humulin R。经15～16 d清洗期后进行第2次试验，交叉给药，即第1组sc Humulin R，第2组sc Insulin R，剂量和给药体积同前。动物给药后6 h统一饲喂。 1.2.3 样品收集与存放

受试动物于颈背部sc Insulin R和Humulin R，给药体积为0.1 mL/kg。于0 h（药前）、0.17、0.33、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6 h（药后），从前肢头静脉采血约2 mL，一滴全血即刻用于血糖测定，其余肝素钠抗凝，低温（4 ℃）3 000 r/min离心20 min，制备血浆，分装2管。其中1管加入抑肽酶（500 kU/mL血浆）以防C肽发生蛋白水解。所有待测样品于−20 ℃保存，直至测定。 1.2.4 Beagle犬校正后血药浓度测定

由于正常动物体内含内源性胰岛素，将干扰血药浓度测定。通常胰岛素和C肽在体内是等分子分泌，测定血浆中犬C肽水平可用于校正内源性胰岛素的水平。本研究采用定量检测特异性犬C肽试剂盒，与胰岛素同步检测血浆中犬C肽浓度以扣除犬内源胰岛素对外源性胰岛素测定的影响。具体方法为：I_ex(t)=I_t0(t)－[C_(t)I_(t=0)/C_(t=0)]，其中I_ex(t)是注射后t时间的校正胰岛素浓度，I_t0(t)是注射后t时间的总胰岛素浓度，C_(t)是t&l t;/ i>时的C肽浓度，I_(t=0)]是初始内源性胰岛素浓度，C_(t=0)是初始时C肽浓度^[6,7]。采用RIA法测定的各时间点胰岛素浓度减去相应时间点的C肽浓度后，得到校正后的胰岛素浓度。 1.2.5 药效学/药动学参数及生物等效性计算

所有试验数据均以x± s表示，血药浓度-时间测定数据采用DAS 3.0（北京博之音科技有限公司）药动程序，非房室模型拟合计算药动参数，包括清除率（CLz）、表观分布容积（Vz）、消除半衰期（t_1/2），达峰时间（t_max）和峰浓度（C_max）采用实测值，药时曲线下面积（AUC）采用统计矩法计算。药效参数最低葡萄糖浓度（C_min）和达到最低浓度所需时间（t_min）采用 实测值。生物利用度以F表示，F=AUC_{(0~t) Insulin R}/AUC_{(0~t) Humulin R}×100%，并采用双向单侧t检验、90%置信区间分析对两种制剂进行生物等效性评价。 2 结果 2.1 血糖测定结果

12只健康Beagle犬交叉sc受试药Insulin R和对照药Humulin R后吸收迅速，药后10 min血糖水平已显著低于给药前水平（4.9/3.7 mmol/L vs 4.9/3.9 mmol/L），随后血糖水平持续降低，并于0.5～2 h达到谷值（1.9 mmol/L vs 1.8 mmol/L），2 h后血糖水平逐步回升，于5～6 h恢复至给药前水平。两药平均血糖浓度-时间曲线的比较见图 1。

图 1 Beagle犬分别sc Insulin R和Humulin R后的平均血糖水平变化时间曲线 Fig. 1 Mean blood glucose - time curves following sc administration of Insulin R and Humulin R in Beagle dogs

标准曲线是用药盒提供的胰岛素对照品溶液（Insulin，kit）、Insulin R和Humulin R分别配制，其终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μU/mL。按“Millipore人胰岛素特异试剂盒测定原理及方法”项下测定各标准管的cpm值，每个浓度双复管。结果按机内程序选用自动二次拟合程序进行数据处理，绘制标准曲线。在3.125～200 μU/mL时，药物浓度对数与B/B₀呈&l t;/ span>Logistic线性相关。结果显示，胰岛素对照品、Insulin R和Humulin R标准曲线基本平行。每批试验均制备各自标准曲线。Insulin R和Humulin平均标准曲线方程分别为：Y＝6.806＋87.515/[1＋(X/30.755)^1.301]（n=16条）和Y＝6.365＋88.087/[1＋(X/30.889)^1.267]（n=14条）。本方法的最低定量限为标准曲线的最 低 浓度点，即</ span>3.125 μU/mL。 2.2.2 精密度和准确度试验

在标准曲线范围内用对照品稀释液将Insulin R和Humulin R稀释成低、中、高浓度（7.5、28、130 μU/mL），测定批内和批间的精密度和准确度，每个浓度重复测定6次。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 RIA法测定Beagle犬血浆中Insulin R和Humulin R的精密度和准确度 Table 1 Precision and accuracy of Insulin R and Humulin R in plasma of Beagle’sdogs using RIA method 药物 浓度/ (μU·mL−1) 日内精密度 日间精密度 测定浓度/(μU·mL−1) RSD/% RE/% 测定浓度/(μU·mL−1) RSD/% RE/% Insulin R 7.5 7.2±0.6 8.5 96.2 7.9±0.3 3.9 105.0 28 30.4±2.8 9.1 108.6 28.5±1.5 5.3 101.9 130 132.6±7.6 5.7 102.0 129.4±7.5 5.8 99.5 Humulin R 7.5 7.1±0.7 9.8 94.6 7.9±0.5 6.1 105.5 28 30.4±1.7 5.7 108.6 28.9±1.1 3.8 103.3 130 141.2±5.2 3.7 108.6 122.9±9.7 7.9 94.5

表 1 RIA法测定Beagle犬血浆中Insulin R和Humulin R的精密度和准确度 Table 1 Precision and accuracy of Insulin R and Humulin R in plasma of Beagle’sdogs using RIA method

分别配制7.5、28、130 μU/mL Insulin R和Humulin R质控样品，分别在−20 ℃储存60 d、−20 ℃储存1 d、4 ℃储存1 d和单次冻融4种不同条件下保存，次日上午室温下解冻后立即测定，每个样本重复测定4次，见表 2。结果显示，在−20 ℃条件下，保存60 d、1 d、或中途在4 ℃下解冻1 d再冻存，以及在4 ℃保存1 d，各浓度样品的测定结果与−20℃条件下保存1 d样品的测定比较，差异均无显著性。

表 2(Table 2)

表 2 RIA法测定不同保存条件下Beagle犬血浆中Insulin R和Humulin R样品稳定性试验 Table 2 Stability of Insulin R and Humulin R in plasma of Beagle’s dog under different storage conditions using RIA method 药物 浓度/ (μU·mL−1) −20 ℃储存60 d −20 ℃储存1 d 4 ℃储存1 d 单次冻融 测定浓度/ (μU·mL−1) RE/% 测定浓度/ (μU·mL−1) RE/% 测定浓度/ (μU·mL−1) RE/% 测定浓度/ (μU·mL−1) RE/% Insulin R 7.5 7.9±0.3 105.5 8.0±0.3 106.0 7.6±0.4 101.4 7.7±0.8 102.2 28 28.4±1.4 101.5 31.7±1.5 113.2 30.9±2.0 110.2 27.9±1.2 99.5 130 125.5±9.8 96.5 112.0±6.0 86.2 117.2±4.9 86.2 119.6±14.1 92.0 Humulin R 7.5 7.4±0.9 98.8 7.6±1.6 101.3 7.0±0.8 93.7 7.5±0.4 99.3 28 27.3±1.6 97.4 31.3±2.3 111.9 31.8±2.9 113.5 27.7±0.8 99.0 130 135.3±7.1 104.0 132.7±7.7 102.0 135.6±9.2 104.3 139.7±5.2 107.4

表 2 RIA法测定不同保存条件下Beagle犬血浆中Insulin R和Humulin R样品稳定性试验 Table 2 Stability of Insulin R and Humulin R in plasma of Beagle’s dog under different storage conditions using RIA method

制备高浓度Insulin R和Humulin R的犬血浆样品（400 μU/mL），用犬空白血浆倍比稀释，稀释度分别为1∶4、1∶8、1∶16，稀释后样品用本方法测定。检测实测值与期望值间的关系，并计算期望指数（实测值/期望值×100%）。Insulin R和Humulin R期望指数分别在94.0%～86.6%、108.5%～83.7%，结果表明当稀释度不大于1∶16时，用犬空白血浆稀释样品对测定结果影响不大。 2.2.5 特异性试验

选择胰岛素原、胰高血糖素、生长抑素、促黄体生成素、卵泡刺激素5种多肽或蛋白类激素进行特异性试验。配制相当于Insulin R和Humulin R标准曲线最高浓度的20、5、0.8倍（4.0、1.0、0.16 mU/mL）进行测定。结果显示，所测定的浓度值均低于本方法的最低定量限，表明上述被检蛋白对测定结果均不存在明显干扰。 2.3 RIA法测定Beagle犬血浆C肽水平 2.3.1 标准曲线、线性范围和最低定量限

标准曲线是用药盒提供的犬C肽标准品，制备其终质量浓度为0.172、0.344、0.688、1.375、2.75、5.5、11、22 ng/mL。按“Millipore犬C肽试剂盒测定原理及方法”项下测定各标准管的cpm值，每个浓度双复管。结果按机内程序选用自动二次拟合程序进行数据处理，制得标准曲线。在此浓度范围（0.172～22 ng/mL）时，药物浓度对数与B/B₀呈Logistic线性相关。每次试验均制备一条标准曲线 ，平均标准曲线方程为Y＝0.498＋98.325/[1＋(X/2.407)^1.054]。本方法的最低定量限为标准曲线的最低浓度点，即0.172 ng/mL。 2.3.2 精密度和准确度试验

用标准品稀释液配制犬C肽浓度，即在标准曲线范围内选择低、中、高浓度（0.7、1.8、7.0 ng/mL），测定C肽批内和批间的精密度和准确度，每个浓度重复测定6次和8次。结果C肽批内和批间的精密度分别为（10.8±7.3）%、（5.9±2.5）%，批内和批间的准确度分别为（94.8±3.8）%、（96.6±4.6）%，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 RIA法测定Beagle犬血浆中C肽的精密度和准确度 Table 3 Precision and accuracy of C peptide in plasma of Beagle’s dogs using RIA method 浓度/ (ng·mL−1) 日内精密度（n=6） 日间精密度（n=8） 测定浓度/(ng·mL−1) RSD/% RE/% 测定浓度/(ng·mL−1) RSD/% RE/% 0.7 0.65±0.12 18.7 92.1 0.71±0.06 8.8 101.8 1.8 1.79±0.16 9.2 99.2 1.70±0.09 5.0 94.6 7.0 6.51±0.29 4.4 93.0 6.54±0.26 4.0 93.4

表 3 RIA法测定Beagle犬血浆中C肽的精密度和准确度 Table 3 Precision and accuracy of C peptide in plasma of Beagle’s dogs using RIA method

分别配制0.7、1.8、7.0 ng/mL C肽质控样品，分别在−20 ℃储存60 d、−20 ℃储存1 d、4 ℃储存1 d和单次冻融4种不同条件下保存，次日上午室温下解冻后立即测定，每个样本重复测定4次。结果显示，在−20 ℃条件下，保存60、1 d、抑或中途在4 ℃下解冻1 d再冻存，以及在4℃保存1 d，各浓度样品的测定结果与−20 ℃条件下保存1 d样品的测定比较，差异均无显著性。 2.3.4 稀释度试验

由于C肽为Beagle犬血浆中的内源性物质，血浆浓度较低，无需进行稀释，因此未进行C肽稀释度的考察。 2.3.5 特异性试验

本试剂盒与犬C肽交叉率为100%，人C肽为15%，人前胰岛素为0%^[8]。 2.4 Beagle犬血浆中Insulin R、Humulin R及犬C肽水平测定

由于正常动物体内含有内源性胰岛素，测定Beagle犬血浆C肽浓度以校正内源性胰岛素水平^[9]。采用RIA法测定的各时间点胰岛素浓度减去相应时间点的C肽浓度后，得到校正后的胰岛素浓度，12只健康Beagle犬交叉sc受试药Insulin R和对照药Humulin R后的平均药时曲线见图 2。

图 2 Beagle犬sc Insulin R和Humulin R后的药时曲线Fig. 2 Mean plasma concentration - time curvesafter sc administration of Insulin R and Humulin R in Beagle dogs

Beagle犬分别sc Insulin R和Humulin R后，药物吸收较快，约在0.5 h到达峰浓度；在血药浓度升高的同时，伴随着血糖的降低，约在1 h时降至最低；随着血药浓度的降低，血糖水平也逐渐升高，药后5 h基本恢复到给药前的血糖基础水平，此时血药浓度仅维持在最高浓度的1/50（个别动物已检测不到）。Insulin R和Humulin R两者的变化趋势基本一致。见图 3。

图 3 Beagle犬sc Insulin R和Humulin R后PK-PD与时间变化曲线Fig. 3 PK-PD and time change curves after sc administration of Insulin R and Humulin R in Beagle dogs

将校正后的胰岛素浓度数据用DAS 3.0药动学计算程序进行数据处理，计算药动学参数，见表 4。药时曲线下的残留面积AUC_{6 h-∞}占总面积AUC_0-∞比例的均值分别为（2.0±2.2）%、（1.3±0.8）%，符合小于20%的要求，表明采样终点适宜，所得血药浓度及药动学参数均能反映这两种注射剂的动物体内代谢过程。

表 4(Table 4)

表 4 Beagle犬sc Insulin R和Humulin R后药动学参数比较 Table 4 Comparison on pharmacokinetic parameters after sc administration of Insulin R and Humulin R in Beagle dogs 参数 单位 Insulin R Humulin R t1/2 h 0.86±0.49 0.91±0.29 tmax h 0.43±0.21 0.42±0.09 Cmax μU·mL−1 203.2±63.3 193.5±63.1 CLz/F L·h−1·kg−1 1.791±0.321 1.943±0.460 Vz/F L·kg−1 2.163±1.152 2.510±0.785 AUC0-6 h μU·mL−1·h−1 281.2±47.5 266.6±62.5 AUC0-∞ μU/mLh 287.1±49.2 270.1±62.5 MRT0-6 h h 1.32±0.24 1.26±0.14 FAUC0-6 h % 109.4±25.5

表 4 Beagle犬sc Insulin R和Humulin R后药动学参数比较 Table 4 Comparison on pharmacokinetic parameters after sc administration of Insulin R and Humulin R in Beagle dogs

对Insulin R与Humulin R注射剂3个主要药动学参数AUC_{0-6 h}、AUC_0-∞和C_max进行方差分析，结果显示Insulin R与Humulin R在药剂间、周期间和个体间差异均无显著性。并对AUC_{0-6 h}、AUC_0-∞和C_max进行双向单侧t检验和90%置信区间分析，AUC_{0-6 h}、AUC_0-∞和C_max高侧和低侧t检验的等效性检验均合格（P＜0.05），其90%置信区间分别为93.8%～121.2%、94.9%～121.6%、83.5%～135%。用非参数检验法（配对Wilcoxon检验）检验t_max，Insulin R与Humulin R的t_max差异无显著性。该研究结果表明两种制剂具有生物等效性。 3 讨论

胰岛素是胰腺β细胞分泌合成的一种多肽类激素。其主要功能是通过调节细胞的葡萄糖摄取，糖原、脂肪合成及葡萄糖氧化等生化作用来调控血糖水平。胰岛素分泌进入血液循环主要受血糖水平的控制，但亦受其他因素影响，如神经、肠道激素和其他β细胞分泌激素^[8]。Millipore生产的人胰岛素RIA试剂盒，可用于测定人及犬血中的胰岛素。在进行血药浓度检测时，犬内源性胰岛素会干扰目标蛋白的测定结果。如何消除内源物质的干扰是研究胰岛素药动学的关键所在。由于胰岛素和C肽在体内是等分子分泌的，测定血浆中C肽水平可以校正内源性胰岛素的水平。本研究采用定量检测犬C肽试剂盒，与胰岛素同步检测血浆中犬C肽浓度以校正犬内源胰岛素对外源性胰岛素测定的影响。另外Beagle犬给药6 h后统一进食，使基础胰岛素分泌相对较低和稳定，进而对药效学及药动学的影响相对较小。