盐酸曲美他嗪是一种抗心肌缺血的代谢性药物，化学名为1-[(2,3,4-三甲基苯基)甲基]-哌嗪二盐酸盐，相对分子质量为339.3。2001年法国施维雅公司生产的片剂在我国上市，至今该药品在众多省市进入了基本医疗保险药品目录，表明其良好的治疗效果已被相关的管理机关及专家接受，具有良好的市场前景。目前，已广泛采用高效液相色谱法测定盐酸曲美他嗪制剂中有关物质，并且采用自身对照法计算杂质^[1,2,3,4]。本实验采用高效液相色谱法测定盐酸曲美他嗪缓释片中有关物质，使用从英国LGC公司购得杂质A、B、C对照品，采用外标法计算杂质，测定结果更加真实地反映药品的质量，并对杂质产生的原因进行推断。本方法专属性强，准确，灵敏，可更好地控制盐酸曲美他嗪缓释片的质量。 1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国戴安公司）。盐酸曲美他嗪对照品（批号100889-200901，质量分数为99.8%）由中国食品药品检定研究院提供；2,3,4-三甲氧基苯甲醇（杂质A，批号9188，质量分数100%）、4-(2,3,4-三甲氧苄基)-1-哌嗪醛盐酸盐（杂质B，批号8572，质量分数100%）、2,3,4-三甲氧基苯甲醛（杂质C，批号539.04.09.02，质量分数100%）对照品均购自英国LGC公司；盐酸曲美他嗪缓释片，规格35 mg/片，自制。乙腈、甲醇均为色谱纯（Fisher Chemical）；其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件

Diamonsil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.012 mmol/L庚烷磺酸钠溶液（pH 3.5）-甲醇-乙腈（55∶36∶9），体积流量为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为210 nm，进样量：20 μL。理论板数按曲美他嗪峰计算应不低于3 000，杂质A峰与杂质B峰的分离度应大于1.5。 2.2 专属性试验

分别精密称取杂质A、B、C对照品各10 mg和盐酸曲美他嗪对照品20 mg，置10 mL量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，作为贮备液。再精密量取1 mL置200 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为系统适用性试验溶液。取系统适用性试验溶液，进样20 μL，记录色谱图。杂质A峰与杂质B峰的分离度为2.2。在上述色谱条件下，曲美他嗪与相邻杂质、各杂质之间均有良好的分离，见图 1。

1-杂质A 2-杂质B 3-杂质C 4-曲美他嗪 1-impurity A 2-impurity B 3-impurity C 4-trimetazidine dihydrochloride 图 1 系统适用性试验色谱图Fig. 1 Chromatogram of system suitability test

取贮备液适量，用流动相逐步稀释成不同质量浓度，在上述色谱条件下，分别进样20 μL。按信噪比S/N=3测定其检出限，按信噪比S/N=10测定其定量限。曲美他嗪、杂质A、杂质B和杂质C的检出限分别为10.2、4.4、4.5、8.0 ng，定量限分别为30.0、13.8、13.1、24.0 ng。 2.4 线性关系考察

取贮备液，用流动相逐级稀释，配制0.002、0.005、0.010、0.020、0.050 mg/mL对照品溶液（以盐酸曲美他嗪质量浓度计）。分别取上述溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程。盐酸曲美他嗪：A＝5 839.1 C－0.451 3，r＝1.000 0；杂质A：A＝56.755 C－0.931 2，r＝0.999 8；杂质B：A＝59.941 C－1.8247，r＝0.999 5；杂质C：A＝33.652 C＋2.677，r＝0.999 1。结果显示盐酸曲美他嗪以及杂质A、B、C在0.002～0.05 mg/mL与峰面积均呈良好的线性关系。 2.5 精密度试验

取2.2项下0.01 mg/mL系统适用性试验溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果曲美他嗪、杂质A、杂质B、杂质C峰面积RSD值分别为0.1%、0.1%、0.2%、0.2%。 2.6 稳定性试验

称取批号131101样品适量，约含盐酸曲美他嗪10 mg，置100 mL量瓶中，分别加入杂质A、B、C各10 mg，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。分别于0、2、4、8、12 h，取20 μL进样，记录色谱图。结果曲美他嗪、杂质A、B、C峰面积RSD值分别为0.3%、0.7%、0.5%、0.4%。表明样品溶液在12 h内稳定。 2.7 重现性试验

称取批号131101样品适量，约含盐酸曲美他嗪10 mg，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，平行操作6份，分别计算盐酸曲美他嗪质量分数，结果盐酸曲美他嗪的平均质量分数为99.39%，RSD值为0.9%。 2.8 回收率试验

称取批号131101样品适量，约含盐酸曲美他嗪25 mg，置50 mL量瓶中，平行操作9份，分别加入盐酸曲美他嗪对照品20、25、30 mg，加流动相溶解并稀释至刻度，制备供试品溶液，进样测定，计算得平均回收率为100.08%，RSD值为0.2%。 2.9 样品测定

取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量，加流动相溶解并稀释制成含盐酸曲美他嗪约1.0 mg/mL的溶液，5 000 r/min离心15 min，取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密称定杂质A、B、C各10 mg，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液。分别精密量取杂质对照品贮备液和供试品溶液各1 mL，置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液。取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。已知杂质按外标法以峰面积计算质量分数，未知杂质按自身对照法计算质量分数。测定结果见表 1，色谱见图 2。

表 1(Table 1)

表 1 盐酸曲美他嗪缓释片中有关物质的测定 Table 1 Determination of related substance in Trimetazidine Dihydrochloride Modified Release Tablets 生产年份 批号 杂质A/% 杂质B/% 杂质C/% 其他单个杂质/% 杂质总和/% 2013 131101 0.12 0.23 0.11 未检出 0.46 131102 0.10 0.34 0.10 未检出 0.44 131101 0.10 0.30 0.12 未检出 0.52 2012 120901 0.13 0.20 0.26 未检出 0.59 120902 0.15 0.26 0.28 未检出 0.69 120903 0.12 0.27 0.24 未检出 0.63 2010 100611 0.38 0.31 0.49 未检出 1.18 100612 0.41 0.29 0.40 未检出 1.10 100613 0.43 0.35 0.44 未检出 1.22

表 1 盐酸曲美他嗪缓释片中有关物质的测定 Table 1 Determination of related substance in Trimetazidine Dihydrochloride Modified Release Tablets

1-杂质A 2-杂质B 3-杂质C 4-曲美他嗪 1-impurity A 2-impurity B 3-impurity C 4-trimetazidine dihydrochloride 图 2对照品（A）和盐酸曲美他嗪缓释片（B）的HPLC图谱 Fig. 2 HPLC chromatograms of reference substances (A) and Trimetazidine Dihydrochloride Modified Release Tablets (B)

样品分别生产于2013、2012、2010年，在同样条件下储藏，对样品的杂质的量进行比较，发现在放置过程中杂质A、C的量逐渐增大，结果见表 1。 3 讨论 3.1 流动相的选择

文献报道^[2]采用甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相测定盐酸曲美他嗪中有关物质，但实验中发现该条件下很难将杂质A和杂质B完全分离。以1 000 mL水中加50 mL庚烷磺酸钠溶液（取无水庚烷磺酸钠5.05 g，加磷酸3 mL，加水稀释至100 mL）-甲醇-乙腈为流动相时，增大乙腈比例，出峰时间明显缩短，但杂质A和杂质B的分离效果越来越差，因此最终选定0.012 mmol/L庚烷磺酸钠溶液（pH 3.5）-甲醇-乙腈（55∶36∶9）。 3.2 检测波长的确定

取盐酸曲美他嗪对照品及杂质A、B、C对照品适量，用流动相为溶剂分别配制成一定的对照品溶液，在200～400 nm波长进行紫外光谱扫描，结果4种物质均在210 nm附近有较大吸收，故选择检测波长为210 nm。